cAMP/Epac/Rap1信号通路调控NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF及酸枣仁皂苷A的作用研究
时间：2023-06-20 19:30:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
杨婷婷，王 慧，石 鹏，滕 柳，李 悦，杜 敏，涂小华，杨光勇，邓 颖
NG2神经胶质细胞是中枢神经系统实质中表达神经元胶质细胞抗原2(neuron glial antigen 2，NG2)的非神经元、非血管性神经胶质细胞。它能够分泌白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[1]，这些物质能够影响中枢神经系统中神经元和胶质细胞的活性。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)作为胞内第二信使，可通过PKA-cAMP反应原件结合蛋白(cAMP response element binding，CREB)、cAMP直接激活的环磷酸腺苷结合蛋白(exchange proteins directly activated by cAMP，Epac)等信号通路，参与睡眠和昼夜节律、调控学习记忆等多种功能[2]。NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF是否与cAMP/Epac/Rap1信号通路有关，目前尚未见报道。
酸枣仁皂苷A(Jujuboside A，JuA)具有镇静催眠的作用。JuA是否通过作用于NG2细胞发挥作用，其机制尚不明确。该研究采用细胞培养的方法，观察cAMP/Epac/Rap1信号通路参与调控NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF的过程，探讨JuA对NG2细胞发挥的作用，揭示JuA的作用机制。
1.1 细胞株NG2细胞株购于青旗(上海)生物技术发展有限公司，编号BFN60803943。
1.2 仪器与试剂MK3型酶标仪(美国Thermo公司)；
ABI7500型自动实时荧光定量PCR(Real-time PCR)仪(美国ABI公司)；
ChemicDocTMXRS+成像(美国Bio-Rad公司)。JuA(纯度>98%，CAS号55466-04-1)购自北京索莱宝科技有限公司；
胎牛血清(批号04-001-1acs)、青霉素-链霉素溶液(批号03-031-1B)均购自以色列BI公司；
DMEM培养基(批号C11330500BT)购自美国Gbico公司；
CCK-8试剂盒(批号02-024-1ACS)购自日本同仁化学研究所；
提取细胞总RNA试剂盒(批号R6834-01)购自广州飞扬生物工程有限公司；
cDNA第一链合成预混试剂(批号A224-10，北京康润诚业生物科技公司)；
2×SuPer SYBR Green qPCR Master Mix试剂盒(批号QP002)购自上海奕杉生物科技有限公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒(批号P0010)购自上海碧云天公司；
兔多抗BDNF(批号bs-0248R)购自美国Bioss公司；
兔单抗IL-1β(批号#31202)、兔多抗TNF-α(批号8184s)均购自美国CST公司；
兔单抗cAMP(批号Ab76238)、兔单抗Epac(批号Ab109415)、兔多抗Rap1(批号Ab113480)均购自美国Abcam公司；
兔多抗GAPDH(批号AB-P-R 001)购自杭州贤至生物有限公司。
1.3 NG2细胞鉴定课题组前期实验经过免疫荧光检测，鉴定该细胞株为NG2细胞[3]。
1.4 NG2细胞的培养与分组处理NG2细胞复苏后，用含DMEM的完全培养基(10% FBS+1%青霉素-链霉素溶液)常规培养，置于5%CO2、37 ℃培养箱中，每2 d换液1次，待细胞融合度至80%时传代。将细胞分为对照组(完全培养基)、百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)组(特异性增加细胞内cAMP含量5 μmol/L+完全培养基)、ESI-09组(Epac特异性拮抗剂1.5 μmol/L+完全培养基)、JuA组(最佳浓度的JuA+完全培养基)、阳性药组(75 μmol/L艾司唑仑+完全培养基)。
1.5 CCK-8法检测JuA对NG2细胞存活率的影响取对数生长期的NG2细胞，96孔板按每孔8×103个/100 μl接种，设置6个复孔，置于5%CO2、37 ℃培养箱中24 h。吸弃孔内的完全培养基，向培养板中加入100 μl含不同浓度(5、10、20、40 μmol/L JuA)的完全培养基。孵育24 h后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，避光继续孵育1 h。酶标仪检测各组450 nm处的吸光度(absorbance，A)，计算细胞存活率。
1.6 RT-PCR法检测IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA相对表达量取6孔板，按2×105个/孔接种细胞。按上述分组干预细胞。应用NCBI中Primer-BLASTPCR设计引物，见表1。采用试剂盒提取总RNA，逆转录cDNA。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因。反应体系为：2×SYBR Green qPCR Mix 10 μl、ROX 0.4 μl、上游引物0.5 μl、下游引物0.5 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 7.8 μl；
反应条件为：95 ℃ 5 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 30 s，共40个循环。采用2-△△Ct法对结果进行分析，计算相对表达量。
表1 基因引物序列
1.7 Western blot法检测IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1蛋白相对表达量取对数生长期的NG2细胞，按2×105个/孔接种至6孔板中。按1.4项分组干预细胞。按蛋白提取试剂盒提取各组NG2细胞蛋白，应用BCA蛋白检测试剂盒定量，电泳分离后，转移至 PVDF 膜；
经封闭、一抗孵育(稀释度均为1 ∶1 000)，TBST洗膜，HRP标记二抗(1 ∶10 000)孵育，TBST洗膜后，应用ChemicDocTMXRS+成像显影，计算IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1相对蛋白表达量。
2.1 JuA对NG2细胞存活率的影响为了检测JuA对NG2细胞存活率的影响，本实验选取浓度为0～40 μmol/L JuA干预细胞。与0 μmol/L组比较，20、40 μmol/L JuA组细胞存活率降低，差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，JuA的浓度低于10 μmol/L时对NG2细胞存活率无明显影响。见图1。根据CCK-8法检测结果，已知0～10 μmol/L JuA为安全浓度，因此，选取10 μmol/L JuA用于后续实验。
图1 JuA对NG2细胞24 h存活率的影响(n=6)
2.2 PTX对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP mRNA表达的影响与对照组比较，PTX降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达(P<0.01)，增加BDNF、cAMP mRNA的表达(P<0.01)。见图2。
图2 PTX对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP mRNA表达的影响(n=6)
2.3 PTX对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF蛋白表达的影响与对照组比较，PTX降低IL-1β和TNF-α蛋白的表达(P<0.01)，增加BDNF蛋白的表达(P<0.01)。见图3。
图3 PTX对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF蛋白表达的影响(n=3)
2.4 ESI-09对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1 mRNA表达的影响与对照组比较，ESI-09增加IL-1β、TNF-α mRNA的表达(P<0.05，P<0.01)，降低BDNF、Epac、Rap1 mRNA的表达(P<0.01)。见图4。
图4 ESI-09对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1 mRNA表达的影响(n=6)
2.5 ESI-09对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1蛋白表达的影响与对照组比较，ESI-09增加IL-1β和TNF-α蛋白表达(P<0.01)，降低BDNF、Epac和Rap1蛋白表达(P<0.01)，见图5。
图5 ESI-09对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、Epac、Rap1蛋白表达的影响(n=3)
2.6 JuA对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA表达的影响与对照组比较，JuA增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac和Rap1mRNA的表达(P<0.05，P<0.01)；
阳性药增加BDNF、IL-1β、TNF-α、cAMP、Epac和Rap1 mRNA的表达(P<0.05，P<0.01)。见图6。
图6 JuA对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA表达的影响(n=6)
2.7 JuA对NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1蛋白表达的影响与对照组比较，JuA增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac和Rap1蛋白表达(P<0.01)；
阳性药增加IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac和Rap1蛋白表达(P<0.01)。见图7。
NG2细胞作为中枢神经系统中一类新型神经胶质细胞，不仅能够表达γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)等神经递质受体，还表达Na+、K+、Ga2+、Cl-等电压门控性离子通道。Glu和GABA是脑内兴奋性和抑制性的神经递质。课题组前期研究[4]显示，NG2细胞的兴奋性受到抑制后可影响大鼠中缝核内Glu和GABA的含量。NG2细胞与Glu能和GABA能神经元产生功能性突触连接，并接受神经元突触信号输入，对兴奋性和抑制性信号作出反应，在中枢神经系统信息传递和神经元活动的调节中发挥重要作用。NG2细胞能够产生α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicaci，AMPA)受体介导的突触后兴奋性电流，并以剂量依赖性方式抑制其增殖，这些效应的发生是由神经元引发的Glu信号转导所调节的[5]。表明NG2细胞可能与中枢神经系统的兴奋性有关。
在中枢神经系统中，cAMP/Epac信号通路在细胞中普遍表达，不仅参与细胞正常的生理活动，还参与中枢神经轴突再生、炎症反应、细胞黏附、睡眠调节等功能[6]。研究表明增加细胞内cAMP可抑制TNF-α和IL-1β的释放[7]，细胞以cAMP/Epac依赖性方式产生BDNF[8]。表明cAMP/Epac信号通路能够介导细胞分泌IL-1β、TNF-α和BDNF。Rap1激活是由各种细胞外刺激诱导的，并且通过cAMP与Epac信号传导密切相关。Rap1的激活也能抑制IL-1β、TNF-α细胞因子的产生[9]。cAMP/Epac/Rap1是否参与调控NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α、BDNF值得进一步研究。本研究使用特异性增加细胞内cAMP含量的PTX，发现PTX可减少NG2细胞IL-1β、TNF-α mRNA和蛋白的表达，增加BDNF和cAMP mRNA和蛋白的表达。然而使用ESI-09后，IL-1β、TNF-α和BDNF mRNA和蛋白表达与PTX趋势相反，Epac和Rap1 mRNA和蛋白表达降低。表明cAMP/Epac/Rap1信号通路参与NG2细胞分泌IL-1β、TNF-α和BDNF。
图7 JuA对NG2细胞的影响(n=3)
JuA是酸枣仁中的一种关键皂苷，具有抗焦虑和镇静催眠作用，可降低睡眠潜伏期和延长睡眠时间。现代研究[10]表明JuA不仅通过抑制Glu神经元介导的兴奋信号通路，提高GABA神经元受体的基因转录水平，调节肠道黏膜系统上IL-1β、TNF-α等细胞因子的分泌，影响大脑神经细胞之间的细胞因子网络，还通过调节cAMP-PKA信号通路，发挥镇静和催眠作用。JuA如何对NG2细胞发挥作用目前尚未明确。本研究显示JuA可增加NG2细胞IL-1β、TNF-α、BDNF、cAMP、Epac、Rap1 mRNA和蛋白的表达，而PTX增加cAMP和BDNFmRNA和蛋白的表达，降低IL-1β和TNF-α mRNA和蛋白的表达。这可能是由于JuA还通过其他信号通路影响NG2细胞分泌IL-1β和TNF-α。研究[11]显示IL-1β、TNF-α可通过上调兴奋性Glu能传递和下调抑制性GABA能传递来增加大脑兴奋性。BDNF通过酪氨酸激酶受体B、N-甲基-D-天冬氨酸受体，改变细胞膜对Ca2+、Na+通透性起到调节神经兴奋性的作用[12]。提示IL-1β、TNF-α和BDNF能够影响皮层兴奋性。本研究进一步发现JuA可能作用于cAMP/Epac/Rap1信号通路调控NG2细胞分泌BDNF，进而影响皮层兴奋性来发挥作用。
综上所述，NG2细胞能通过cAMP/Epac/Rap1信号通路分泌IL-1β、TNF-α、BDNF，JuA可能通过影响NG2细胞的分泌功能及cAMP/Epac/Rap1信号通路来发挥作用。未来本课题组将继续探讨JuA影响NG2细胞分泌IL-1β和TNF-α有关的信号通路。
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