杨梅素对脱矿牙本质再矿化及树脂-牙本质粘接效果的影响
时间：2023-05-30 15:20:15 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王贝贝，韩 菲，袁晓君，陈 晨，谢海峰
黄酮类物质是一种多羟基类化合物，生物安全性高，作用范围广，具有较强的抗氧化、抗炎、抗菌和镇痛作用，其中的特征性基团酚羟基(—OH)可以与生物大分子(如胶原的羟基、羧基、氨基和酰胺基)之间形成氢键而有效结合在一起，并促进胶原交联，提高稳定性；
还可以形成离子键和共价键，与金属阳离子(如Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、Cu2+)发生螯合，这可能为促进牙本质胶原再矿化提供了必要条件[1-5]。杨梅素(myricetin，MYR)是天然黄酮类化合物中的一种，有学者发现MYR与成牙本质细胞样细胞之间具有良好的生物相容性，还可介导牙本质胶原交联，在临床环境中有效地稳定树脂-牙本质混合层，降低深层裸露的胶原纤维被降解的风险[6-7]。MYR是否对脱矿的牙本质具有再矿化活性尚未见研究报道，本研究通过评价MYR对脱矿牙本质基质的再矿化效果及其对牙本质粘接强度的影响，为临床应用提供实验数据。
1.1 样本制备
经南京医科大学伦理委员会批准(伦理号PJ2022-076-001)，于2021年7月—8月在口腔颌面外科门诊收集新鲜拔除、无龋坏的第三磨牙，并保存在0.01%叠氮化钠溶液中。流动水冷却下用低速金刚砂切割机(Isomet 1000，Buehler，美国)获取1 mm厚的中层牙本质，后用高速手机制备大小为5 mm×7 mm的牙本质样本，使用牙科显微镜(OMS2350，Zumax，中国)仔细检查所有牙本质表面，以确保没有残留的牙釉质或牙髓。每个样本表面用600目碳化硅砂纸湿抛光30 s，形成标准的玷污层。
1.2 溶液配制
再矿化溶液(SBF)按照Chen等[8]的方法制备，将含钙溶液和含磷溶液混合，其中含钙溶液包括20 mmol/L CaCl2、18 g/L NaCl、14 g/L Tris和700 μg/mL PAA；
含磷溶液包括12 mmol/L Na2HPO4，上述产品均来自中国麦克林公司。将新鲜配制的SBF溶液放置4 ℃保存备用，保存时间<1个月。
MYR溶液配制：将MYR(麦克林，中国)溶于无水乙醇中，制备成600 μmol/L的MYR溶液。
1.3 分组处理
根据有无MYR预处理和再矿化处理将样本分为空白对照组(CON组)、阴性对照组(POS组)和实验组(MYR组)。①CON组：35%的磷酸凝胶(格鲁玛，德国)酸蚀样本15 s，部分脱矿后浸泡在蒸馏水中2 d；
②POS组：35%的磷酸凝胶酸蚀样本15 s，去离子水预处理30 min后进行再矿化处理，即将样本在SBF中培养2 d，放置在37 ℃、100 r/min摇床上，每天更换SBF；
③MYR组：35%的磷酸凝胶酸蚀样本15 s，MRY溶液预处理30 min，再矿化处理同POS组。
1.4 形态学观察及化学表征
各组中随机选取5个样本进行扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)分析，选取表面形态较好的样本提交X射线衍射(X-ray diffraction，XRD)和衰减全反射傅里叶变换红外光谱(attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)分析。
将各组样本在流动水下彻底冲洗干净以去除表面未结合的物质，空气中充分干燥后在SEM(MAIA3 TESCAN，捷克)下观察，参数如下：预先喷铂金，背散射电子模式，20 kV加速电压，工作距离约5 mm。
XRD检测样本在射线衍射仪(D8 ADVANCE，Bruker AXS，德国)上进行，工作电压为40 kV，电流为200 mA。在室温下使用Ni过滤的CuK(λ=1.541 8Å)辐照，步长=0.02°，描速速率为1°/min，扫描范围2θ=20°～60°，记录实验结果。
ATR-FTIR检测样本采用配有钻石晶体衰减全反应附件的分光光度计(Nicolet 5700FTIR，Nicolet，美国)，光谱采集范围为800～1 800 cm-1，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次，获得的光谱使用Origin 2021软件对其进行平滑、基线校正和归一化处理。
1.5 纳米渗漏实验
将处理后的各组样本按产品说明将粘接剂(Single Bond 2，3M ESPE，美国)涂布在表面，光固化灯下固化10 s，然后将复合树脂(3M ESPE，美国)分两层堆置到涂布粘接剂的牙本质表面上，每层2 mm，牢固压实并光固化40 s，获得树脂-牙本质粘接样本。将每组树脂-牙本质粘接样本在37 ℃的蒸馏水中保存24 h。使用低速切割机垂直粘接界面切取横截面为1.0 mm×1.3 mm的粘接试件。各组中随机选取3个柱状试件在质量分数为50%的银氨溶液中避光放置24 h后，将试件取出用流动水洗净，置于显影液中，在荧光灯下照射8 h，结束后试件再次用流动水冲洗。依次使用1 200、1 500、2 000、2 500、3 000目碳化硅砂纸进行打磨抛光。在使用一种目数砂纸抛光后，超声清洗15 min。抛光结束后，试件常规干燥24 h后喷金处理。SEM在20 kV的加速电压下以背散射模式进行观察。
1.6 微拉伸强度(micro tensile strength，μTBS)检测
按照1.5中的方法制备获得树脂-牙本质粘接样本，在样本中心部位使用低速切割机切割获得横截面为1 mm×1 mm的粘接试件，在万能试验机(Instron 3365 ElectroPuls，Instron，美国)上进行μTBS测试。粘接试件以1 mm/min的速度进行拉伸直至试件断裂，记录最大载荷。μTBS值=试件断裂时的最大载荷÷粘接面积。
1.7 统计学分析
计算各组平均值±标准差，利用SPSS 21.0软件对μTBS进行单因素方差分析，P<0.05被认为差异有统计学意义。
2.1 SEM形态学观察
CON组牙本质表面的牙本质小管保持完全开放状态，牙本质小管侧壁上胶原纤维形态暴露，甚至出现胶原纤维间缝隙；
POS组牙本质小管管腔内及管壁胶原纤维周围有少量晶体形成，胶原形态变模糊，而MYR组牙本质小管内晶体沉积量进一步增加，胶原纤维被矿物质完全包裹，无明显间隙出现(图1)。
2.2 XRD和ATR-FTIR分析
各组样本XRD结果如图2所示，在2θ=25.90°、2θ=31.85°、2θ=32.28°和2θ=32.92°处有羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)的典型衍射峰，分别为(002)，(211)，(112)和(300)衍射峰。
CON组牙本质的(002)反射衍射强度与(211)反射衍射强度的比值为0.295，POS组和MYR组该值依次增大(0.363和0.424)，这表明HA的取向是沿c轴的。
2.3 纳米渗漏
各组树脂-牙本质界面的典型纳米渗漏图如图4所示。CON组混合层中有范围较广、密集且连续的银离子沉积；
POS组纳米银颗粒沉积的范围减小且不连续；
而MYR组混合层中颗粒沉积显著下降，表现为少量分散沉积。
2.4 μTBS检测结果
CON组、POS组和MYR组的μTBS值分别为(29.25±3.63)MPa、(36.65±3.16)MPa和(47.87±4.68)MPa，各组之间差异均有统计学意义(P<0.05)。
本实验使用全酸蚀系统对牙本质进行表层脱矿处理，研究了MYR作为牙本质胶原交联剂，是否可以通过非经典再矿化过程——聚合物诱导液体前体(polymer-induced liquid precursor，PILP)的方法促进矿物质重新沉积在裸露的胶原纤维周围，进而改善树脂-牙本质粘接强度。PILP是目前公认的脱矿牙本质基质发生仿生再矿化的方法，与传统的由上至下的再矿化理论不同，PILP是一种由下而上的非经典再矿化方法，是纳米级无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate，ACP)颗粒渗透至脱矿牙本质深层，并自发沉积至胶原纤维内和胶原纤维间，而非依附于种子晶体的再矿化过程[9-12]。据报道， 胶原纤维和残留的HA晶种虽有助于吸收钙离子和磷离子，但再矿化发生的速度较慢，4周后，表面也只有少量的矿物沉积[13]。因此采取加快再矿化进程的措施是极其重要的。
基于Baldion等[6]对MYR的研究，本实验选用了600 μmol/L作为MYR实验浓度，在此浓度下，MYR可以维持成牙本质细胞的活性，并可达到与其他基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制剂(如原花青素和乙二胺四乙酸)相似的抑制作用，稳定胶原，在一定程度上改善树脂-牙本质粘接强度，但对脱矿牙本质基质再矿化有何作用，目前尚不可知。
本研究观察到MYR预处理后，脱矿牙本质再矿化有更多的HA形成，说明MYR对再矿化有促进作用。MYR是含有多个—OH的单分子化合物，可满足与牙本质胶原纤维发生结合的同时利用游离—OH吸引矿化液中的钙离子，加速矿物质形成，使深层裸露的牙本质胶原纤维得以在较短的时间内重新被无机物包裹，胶原纤维间缝隙减少[6，14]，与本实验结果相似。
纳米渗漏结果显示再矿化处理后的样本纳米渗漏量有所减少，使用MYR预处理后可进一步减少。纳米渗漏量的下降意味着混合层胶原纤维周围水分子质量的减少，而水分子是直接导致或通过激活MMPs间接导致胶原降解并破坏树脂-牙本质粘接效果的“催化剂”[15-16]。ACP颗粒可以渗透至胶原纤维内部和胶原纤维间并在渗透差的作用下置换出水分子[17]，而MYR则以氢键结合的方式代替胶原纤维上或周围的结合水或游离水，并由于本身的疏水性能避免了水的渗入，形成一道胶原纤维的保护屏障[6]。
为了进一步观察MYR对树脂-牙本质粘接性能的影响，本实验进行了μTBS测试实验。结果表明，再矿化处理有提高树脂-牙本质的粘接强度的作用，而MYR溶液预处理则可以进一步增强。有研究发现导致树脂-牙本质粘接失败的原因主要是混合层的破坏。混合层深层的胶原纤维无法被树脂单体完全包裹而裸露，其机械性能较差，且易受到水和MMPs的攻击[16，18]。本研究中，MYR预处理后脱矿样本再矿化胶原纤维被矿物质完全包裹，无明显间隙出现，MYR通过促进矿物质对裸露胶原纤维的沉积包裹而产生保护作用，增加了混合层的机械强度，提高了μTBS值，明显改善了树脂-牙本质的粘接效果。
此外，本实验中MYR溶液采用的溶剂是无水乙醇，有学者发现无水乙醇可逐步脱水和产生水置换，减少胶原基质中的水分子，从而保护胶原，这和MYR的结合及ACP颗粒的沉积有协同作用[19]。
综上，MYR可有效促进混合层牙本质胶原纤维再矿化的发生并改善树脂-牙本质的粘接强度。
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