注射用盐酸吉西他滨无菌方法验证
时间：2021-02-05 04:01:26 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
[摘要] 目的 对注射用盐酸吉西他滨的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。 方法 按中国药典2010附录ⅪH无菌检查方法进行。 结果 在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。结论 可以采用此法对本品进行无菌检查。
[关键词] 注射用盐酸吉西他滨；无菌方法；验证
[中图分类号] R927 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）04-55-02
盐酸吉西他滨（gemcitabine hydrochloride）化学名2-脱氧-2，2-盐酸二氟脱氧胞苷（β-异构体），是一种阿糖胞苷类似物，由美国礼来公司研发的核苷类抗代谢抗癌药[1]。属于新型抗嘧啶核苷酸代谢化疗药物，属细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，即S期细胞。在一定条件下，可以阻止G1期向S期的进展；具有抗瘤谱广、作用机制独特、毒性反应低、与其他化疗药物无交叉耐药且毒性反应无叠加等特点。在过去的临床工作中，观察到盐酸吉西他滨是疗效较好而毒副反应较少的化疗药物之一[2-3]。无菌检查、细菌内毒素、微生物限度检查是药品安全性检查的重要项目[4]，本品为冻干粉针按照中国药典2010版附录ⅠB[5]的要求，要进行细菌内毒素检查。
1 材料与方法
1.1 仪器
HTY-2000A全封闭集菌仪和NKF集菌培养器（杭州高德泰林有限公司），LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅，SP120水夹套恒温培养箱，PYX-DHS-50X65-BS隔水式电热恒温培养箱，MJX-160B霉菌培养箱。AKL1500净化工作台。
1.2 试剂
培养基：硫乙醇酸盐流体培养基，改良马丁培养基，营养琼脂培养基，玫瑰红钠琼脂培养基，0.1%无菌蛋白胨水溶液，0.9%无菌氯化钠溶液。实验菌株：白色念珠菌[CMCC（F）98 001]，黑曲霉[CMCC（F）98 003]，铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]，金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]，枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]，生孢梭菌[CMCC（B）64 941]，大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]以上菌种均为江苏省康华医药科技实业中心。
1.3 方法
1.3.1 样品供试液的制备 取本品160支，每10支用400 mL的0.1%蛋白胨水溶液复溶，平行制备16瓶，作为供试液。
1.3.2 菌液的制备 稀释液为0.9%无菌氯化钠溶液、含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液。
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养，按10倍系列稀释至10-5～10-7。取生孢梭菌的硫乙醇酸盐流体培养基培养物与标准比浊管对比，取与比浊管相当的菌液按10倍系列稀释至10-7。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，培养，按10倍稀释至10-5、10-6备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7 d，加入3～5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1毫升含孢子数50～100 cfu的孢子悬液。取上述各菌的最后两级稀释菌液各1 mL，平行制备2皿，立即倾注琼脂培养基15～20 mL，营养琼脂培养基平皿于30～35℃培养24～48 h、玫瑰红钠琼脂培养基平皿于23～28℃培养48～72 h，取生孢梭菌的阳性对照菌液1 mL接入100 mL硫乙醇酸盐流体培养基于30～35℃培养18～24 h计数。见表1。
1.3.3 无菌检查[5]过程
1.3.3.1 培养基的灵敏度检查 取12 mL/管的硫乙醇酸盐流体培养基管，分别接种<100 cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌对照菌液各1 mL，另1支作为空白对照；取9 mL/管的真菌培养基管，分别接种
<100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉对照菌液各1 mL，另1支作为空白对照；硫乙醇酸盐流体培养基管于培养3 d；白色念珠菌、黑曲霉于培养5 d。在培养的3～5 d内，空白对照管均无菌生长，加菌的各培养基管均生长良好，判该批硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的灵敏度检查符合规定
1.3.3.2 培养基的无菌性检查 取两种培养基各5瓶，分别置于各自的培养温度下空白培养14 d。空白培养管均无菌生长，判该批硫乙醇酸盐流体培养基、改良马丁培养基的无菌性检查符合规定。
1.3.3.3 方法 方法1：取一套二联培养器用30～50 mL 0.1%蛋白胨水溶液润湿滤膜。将2瓶供试液全量通过一次性使用的全封闭集菌培养器的二个滤器，然后用0.1%无菌蛋白胨水溶液淋洗滤膜（400 mL/膜，100 mL/次），每次均在振荡仪上振摇，使可能附着在培养器壁上的抑菌成分冲掉，在两个滤器中分别加入100 mL的硫乙醇酸盐流体培养基，其中一个滤器加入10～100 cfu的金黄色葡萄球菌，另一个滤器加入10～100 cfu的枯草芽孢杆菌，作为供试品阳性对照管。另取一套培养器，不加供试品，其它同上操作，作为阳性对照管。另取一套滤器，除供试品外同上操作，其中一管加入100 mL的硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入100 mL的改良马丁培养基，作为阴性对照。取供试品与铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同上法操作。其中白色念珠菌、黑曲霉用改良马丁培养基。方法2：同上操作，冲洗液的用量为600 mL/膜，100 mL/次。
2 结果
观察、记录结果分析，见表2、3。
3 讨论
采用方法1检查，供试品阳性对照管（白色念珠菌、黑曲霉）均显见有微生物生长，且与阳性对照管相近，但供试品阳性对照管（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌）虽见有微生物生长，与阳性对照管比较，生长比较微弱且缓慢，说明在此条件下，供试品对微生物的生长还有一定的抑制作用。
采用方法2检查，供试品阳性对照管（白色念珠菌、黑曲霉、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌）
均显见有微生物生长，与阳性对照管比较，微生物生长明显，说明在此条件下，供试品对微生物的生长无抑制作用。因此，取验证方法2作为注射用盐酸吉西他滨（0.2 g）的无菌检查方法。
[参考文献]
[1] 应荣，黄建，郭红云.盐酸吉西他滨原料合成工艺研究[J].精细化工中间体，2008，38（5）：34-36.
[2] 李留树，王如良.非小细胞肺癌的治疗进展[J].解放军保健医学杂志，2011，3（1）：199-200.
[3] 陈新谦，金有豫，汤光.新编药物学[M].北京：人民卫生出版社，2004：675-676.
[4] 许玉华，杜鹃，汤杨.药品微生物污染检测方法验证的必要性[J].中国药品标准，2005，6（4）：46.
[5] 国家药典委员会编.中国药典二部附录[S].北京：中国医药科技出版社，2010：6，103.
（收稿日期：2013-01-04）
