大豆乙醇酸氧化酶基因的克隆\表达和酶学活性分析
时间：2021-02-05 04:00:43 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：利用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从大豆叶片总ＲＮＡ中扩增了乙醇酸氧化酶（ＧＯ）基因的ｃＤＮＡ序列，克隆到ｐＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ上，进行测序，然后将乙醇酸氧化酶的ｃＤＮＡ克隆至原核表达载体ｐＲＳＥＴ－Ａ上，转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１，并对该基因在Ｅ． ｃｏｌｉ中的表达进行了研究。
关键词：乙醇酸氧化酶；基因克隆；原核表达；酶学活性
中图分类号：Ｑ７８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）01－0172-05
Cloning and Expression of Soybean Glycolate Oxidase Gene in Escherichia coli and Enzyme Activity Analysis
ＬＩ Ｙｉｎｇ１，２，ＫＡＮ Ｇｕｏ－ｓｈｉ１，ＳＵＮ Ｗｅｎ－ｌｉ２，ＬＩ Ｍｅｉ２，ＬＩＵ Ｙｕ－ｈｕｉ２
（１． Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈｅｎｙａｎｇ １１０１６１， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｇｌｙｃｏｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ（ＧＯ） ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｅａｖｅｓ ｂｙ ＲＴ－ＰＣＲ， ａｎｄ ｔｈｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ． Ａｆｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ， ｔｈｅ ＧＯ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＲＳＥＴ－ａ． ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ４０．８ｋＤ ｇｌｙｃｏｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ； ａｎｄ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｇｌｙｃｏｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ； ｃｌｏｎｉｎｇ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； enzyme activity
乙醇酸氧化酶（Ｇｌｙｃｏｌａｔｅ ｏｘｉｄａｓｅ，ＧＯ）［１］广泛存在于菠菜、甜菜、豌豆、西葫芦、莴苣和微生物中，是植物光呼吸过程中的关键酶， 在植物体内，与丝氨酸转氨酶（ＳＧＴ）协同作用，导致Ｈ２Ｏ２积累，杀死病原菌并诱导植物体产生获得性抗性。乙醇酸氧化酶在过氧化氢酶和乙二胺的存在下能高效催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸是一种重要的有机化工中间体，是合成香兰素 （芳香醛）、尿囊素（生物调节剂）、除草剂、羟氨苄青霉素等医药产品的前体。以ＧＯ为主要催化剂生产乙醛酸的方法具有成本低、污染小的特点，是目前生产乙醛酸的首选方法。国外已有利用Ｅ． ｃｏｌｉ、酿酒酵母、毕赤氏酵母、汉逊多形酵母等表达菠菜乙醇酸氧化酶，并将其应用于生产乙醛酸的报道，国内对乙醇酸氧化酶基因的表达和应用的研究较少。１９９０年Ｌｕｄｔ等［２］从兵豆（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）叶片中克隆得到ＧＯ的ｃＤＮＡ，根据其核苷酸序列反推得到了氨基酸序列，共３７１个氨基酸残基，分子量为４０ ８３３Ｄ，与菠菜ＧＯ同源性为９３％，其Ｃ端氨基酸残基为Ｐ－Ｒ－Ａ－Ｐ－Ｒ－Ｌ，与大豆乙醇酸氧化酶非常相似，但未对其进行深入的体外表达研究和编码蛋白的酶学活性分析。因为以菠菜叶子中ＧＯ的含量和活性最高，所以国内目前仅有菠菜乙醇酸氧化酶在Ｅ． ｃｏｌｉ、酵母中表达的报道，而未见大豆乙醇酸氧化酶表达的报道。探索在
Ｅ． ｃｏｌｉ中表达大豆乙醇酸氧化酶的方法，为比较大豆乙醇酸氧化酶和菠菜乙醇酸氧化酶的活性差异，为探索利用大豆乙醇酸氧化酶生产乙醛酸的可行性奠定了基础。
１材料与方法
１．１大豆叶片
新鲜的大豆叶片品种为大白眉－３，采自实验室温室。
１．２菌种和质粒
ｐＭＤ１９－Ｔ ｓｉｍｐｌｅ载体购自ＴａＫａＲａ公司，其余质粒和菌株均为本实验室保存或构建。
１．３工具酶和试剂
逆转录试剂盒购自北京原平皓公司；Ｔ４ ＤＮＡ连接酶、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＥｃｏＲ Ｉ和ＨｉｎｄⅢ均购自ＴａＫａＲａ公司；ＤＮＡ胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；Ｔｒｉｚｏｌ试剂购自盖宁生物公司。
１．４引物
引物Ｐ１、Ｐ２根据ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢ３３３７９０．１的ＧＯ ｃＤＮＡ序列设计，由上海生物工程公司合成。Ｐ１：５′－ＧＡＡＴＴＣＧＡＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＣＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣ
ＧＡＧＴＡＴ－３′为正向引物，Ｐ２：５′－ＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＡＡＴ
ＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧＣＧＣＧＧＧＧＡＡＧ－３′为反向引物，为方便进行载体构建，在引物５′端分别设计了ＥｃｏＲ Ｉ和Ｈｉｎｄ Ⅲ酶切位点。
１．５大豆叶子总ＲＮＡ的提取
取新鲜叶片组织，按每１００ ｍｇ叶片加入１ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ的比例加入Ｔｒｉｚｏｌ，１0 746 r/min，４℃离心１０ ｍｉｎ，取上清，室温静置５ ｍｉｎ，加２００ μＬ三氯甲烷，振荡１５ ｓ，静置２～３ ｍｉｎ，１0 746 r/min，４℃离心１５ ｍｉｎ，取上清，加５００ μＬ异丙醇混匀，室温静置１０ ｍｉｎ，１0 746 r/min，４℃离心１５ ｍｉｎ，沉淀中加入７５％乙醇１ ｍＬ，振荡混匀后，6 716 r/min，４℃离心５ ｍｉｎ，弃上清，将沉淀室温静置５～１０ ｍｉｎ，加２０ μＬ ddH2O（注：ＲＮＡ提取中所用的ddH2O、枪头、离心管均经过ＤＥＰＣ处理）备用。
１．６ＲＴ－ＰＣＲ
在１０ μＬ（约１０ μｇ）总ＲＮＡ中加入１ μＬ Ｏｌｉｇｏ ｄ（Ｔ） １８ Ｐｒｉｍｅｒ（０．５ ｍｇ／ｍＬ），１ μＬ ｄＮＴＰ（１０ ｍｍｏｌ／Ｌ）混合物，６５℃加热５ ｍｉｎ，迅速置冰上冷却５ ｍｉｎ，短暂离心，加入４ μＬ 的５×Fｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｂｕｆｆｅｒ，２ μＬ的０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ，１μＬ的重组ＲＮａｓｅ抑制剂 （４０ Ｕ／μＬ），混匀，４２℃温浴２ ｍｉｎ，加入１ μＬ （２００ Ｕ/μＬ）的Ｔｕｒｂｏ ＲＴ逆转录酶，用移液器上下混匀，４２℃温浴５０ ｍｉｎ，７０℃温浴１５ ｍｉｎ终止反应。取２ μＬ反转录产物，依次加入１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、５ ｍｍｏｌ／Ｌ ｄＮＴＰ ５ μＬ、１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｐ１ １．５ μＬ、１０ μｍｏｌ／Ｌ Ｐ２ １．５ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ３３ μＬ，５ Ｕ/μＬ ｒＴａｑ ＤＮＡ聚合酶１ μＬ，充分混合。ＰＣＲ反应条件为：９５℃预变性５ ｍｉｎ；９４℃、３０ ｓ，６７℃、９０ ｓ，７２℃、９０ ｓ，９个循环；９４℃、３０ ｓ，６５℃、９０ ｓ，７２℃、９０ ｓ，２５个循环；７２℃延伸１０ ｍｉｎ。ＰＣＲ结束后取５ μＬ扩增产物于１．０%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
