[仔猪断奶腹泻大肠杆菌鉴定及其血清型分析] 仔猪大肠杆菌病

　　摘要从浙江省规模化猪场采集仔猪断奶腹泻病料，经细菌分离纯化、G染色、生化试验和小鼠致病性试验等，鉴定得到56株病原性大肠杆菌。通过11种主要致病性大肠埃希氏菌O抗原的血清型鉴定，56株致病性大肠杆菌中定型了33株，共覆盖了11种血清型，其中O149、O139、O8为优势血清型，共17株，占定型菌株的51.52%。通过棉籽糖发酵试验、甘露糖血凝抵抗试验（MRHA）和血凝抑制试验（MRHI），确定37株为K88，占66.07%（其中K88ab有8株，占K88菌株的21.62%），其余的未能定型。这些血清型与已报道的常见血清型间存在一定差异。
　　关键词仔猪断奶；腹泻；大肠杆菌（ETEC）；鉴定；血清型
　　中图分类号S858.28文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0348-03
　　
　　IdentificationofPathogenicE.colifromPostweaningDiarrhoeaandItsSerotypes
　　FENG XianGUAN Miao-dong
　　（Wenling City Animal Husbandry and Veterinary Bureau in Zhejiang Province，Wenling Zhejiang 317500）
　　AbstractRectum swabs samples from postweaning diarrhoea were collected from large pig farms in zhejiang province.56 pathogenic E.coli isolates were obtained after selective medium culture，Gram stain，biochemical tests，and toxicity tests in mice.Serotypes of 33 isolates were identified by agglutination tests with 11 O antigen standard antiserums，the predominant serotypes were O149、O139、O8.，amount to 51.52%（17 isolates）of all the isolates identified. 37 strains were identified as K88 using fermentation tests of raffinose，MRHA and MRHI（K88ab，8 strains，21.62%），the rest isolates serotypes couldn"t be identified when using 4 standard antisera（K88，K99，987P，F41）. These serotypes are different from the common ones reported before.
　　Key wordspostweaning；diarrhea；ETEC；identification；serotypes
　　
　　在现代化养猪生产中，为了最大限度地提高母猪的年生产力，养猪业者期望对仔猪实行早期断奶，国外28日龄断奶应用已较广泛，而在国内，哺乳期少于5周龄的早期断奶尚未普及。实施早期断奶，是提高母猪生产性能的关键技术之一，也是整个养猪业提高效率的主要环节。但早期断奶往往会导致仔猪发生断奶综合征，表现出生长阻滞及消化不良，仔猪断奶后腹泻（Post weaning diarrhoea，PWD）等症状[1]。
　　断奶后腹泻多发生于断奶后2～10 d，是集约化养猪生产中比较棘手的问题，给养猪业造成很大的经济损失[2-3]。Muirhead（1992年）报道，在美国31万头仔猪中断奶腹泻发病率占57%，腹泻造成死亡率10.8%。据统计，杭州市现年产仔猪约300万头，断奶腹泻发病率高达80%，医药费用平均每头2元，但死亡率仍占10%～20%。当发生水样便时，病死率可达30%以上。且仔猪生长缓慢，至60 日龄体重比不发生腹泻的平均要小约1 kg，经济损失巨大。我国是养猪大国，存栏猪逾4亿头，解决仔猪腹泻是提高养猪业总体效益的一个关键问题。
　　国内外研究表明，引起仔猪腹泻的因素是多方面的，总起来讲可分为感染因素和非感染因素[4]。非感染因素包括仔猪自身机能、饲料与饲养管理、断奶应激、所处环境、化学药物应用等，感染因素包括病原体（病毒、细菌、原虫）等，其中又以肠毒素型大肠杆菌（ETEC）最为重要。肠毒素型大肠杆菌（ETEC）是猪的一种重要肠道病原菌，大肠杆菌O抗原血清型很多，资料报道已确定的有173种，常见致病性大肠杆菌血清型是Ｏ8、Ｏ138、Ｏ139、Ｏ141、Ｏ147、Ｏ149、Ｏ157等[5-7]并具有相应的菌毛。菌毛是ETEC的一个重要毒力因子，具有粘附于小肠绒毛上皮的作用，使ETEC牢固地定居于小肠黏膜上，从而导致腹泻的发生[8-10]。
　　对于仔猪断奶腹泻，目前主要通过早期补料减少断奶应激，降低仔猪饲料中蛋白质水平，应用酸化剂、酶制剂、乳清粉和益生素、砷制剂，口服补液盐以及药物防治等措施。这些措施虽取得了一定的防治效果，但并不理想，且长期以来抗生素的大量使用，造成细菌普遍产生抗药性、动物源食品药物残留超标以及环境污染等一系列问题。近年来，采用免疫学方法防治仔猪断奶腹泻效果良好，但不同地区致病性大肠杆菌血清型存在差异，因此有必要开展病原性大肠杆菌优势血清型的鉴定工作。
　　引起仔猪腹泻的菌毛类别主要有K88（F4）、K99（F5）、987P（F6）、F41[11]。常规检测肠毒素性大肠杆菌菌毛的方法有电子显微镜观察法，D-甘露糖抵抗血凝与血凝抑制试验、棉籽糖发酵试验、细胞粘附试验和免疫血清学技术和核酸探针技术等[12]。
　　该项目通过对仔猪断奶腹泻的调查和实验室相应的病原性大肠杆菌的分离纯化、血清型鉴定等试验，探明杭州地区若干大型集约化猪场断奶仔猪腹泻大肠杆菌的抗原特性，并为该病的免疫学防治等研究打下基础。
　　1材料与方法
　　1.1试验材料
　　1.1.1培养基。普通肉汤、营养肉汤、三糖铁培养基、普通琼脂培养基、TSB培养基、改良Minca培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基。
　　1.1.2生化鉴定样品与试剂。11种主要致病性大肠埃希氏菌单因子抗O血清，分别为O8、O20、O9、O101、O147、O64、O138、O45、O149、O157、O139，由中国兽药监察所提供，4种（K88、K99、987P、F41）菌毛抗原单克隆抗体；豚鼠、鸡、兔、猪、羊、鸡、牛红细胞，甘露糖生理盐水、0.5%石炭酸生理盐水、柠檬酸钠、0.9%生理盐水。
　　1.1.3试验菌种。大肠杆菌标准菌株C83901（O8：K87（B），K88ab）、C83902（O8：K887，K88ac）、C83903（O141：K85，K88ab）、C83915（O9：K103，987P：NM）、C83928（O6：K99，F17）购自中国兽药监察所。
　　1.1.4设备及器材。无菌操作台、分光光度计、离心器、天平、移液枪、5 mL注射器（2支）、8号针头若干、离心管（1.5 mL，5 mL）若干、96孔微量血凝板、肠杆菌科细菌生化编码微量鉴定管，棉籽糖发酵管（由浙江省军区后勤部卫生防疫站生产）。
　　1.2试验方法
　　1.2.1病原菌的采集、分离培养和生化鉴定。将采集的病料划线接种于麦康凯琼脂平板。于37 ℃生化培养箱中培养24 h。从麦康凯培养基上挑取单个砖红色菌落再次接种于麦康凯培养基上，37 ℃培养24 h。将纯菌落接种于营养肉汤中，37 ℃培养18 h，获得细菌纯培养物。将纯培养的细菌接种于各种生化鉴定试剂，于37 ℃生化培养箱中培养24 h，并观察结果。
　　1.2.2致病性测定。分离得到的每1株菌株接种普通营养肉汤，将培养18 h后的培养物接种1只健康小白鼠，腹腔注射0.6 mL，同时1只小白鼠注射普通营养肉汤培养物作对照。在正常条件下饲养观察，记录小白鼠的临床症状及死亡时间。12 h以内致死为强毒菌株，12～24 h内致死的为中等毒力毒株，24～48 h致死的为弱毒株，超过48 h致死和耐过的为微弱毒株和无毒株。血平板上选取强毒株和中等毒力毒株接种于营养肉汤，放于37 ℃温箱培养24 h，观察结果。
　　1.2.3大肠杆菌O抗原血清型的鉴定。接种待检大肠杆菌于麦康凯平板上，37 ℃培养24 h。取光滑圆整的红色菌落1～2个转接到半固体小管。取半固体培养物分别接种于普通琼脂斜面上，37 ℃培养24 h。用石炭酸生理盐水2 mL洗下普通琼脂斜面小管培养物，置浓稠悬液小圆底试管中，于121 ℃高压2 h以破坏K抗原，制成高压抗原以供玻板凝集试验使用。参照房海[12]的方法进行操作和判定结果。
　　1.2.4大肠杆菌菌毛型鉴定。①棉籽糖发酵试验。每管接种1个待试菌株，同时设标准菌株及阴性对照管，37 ℃恒温培养4 d，每天观察并记录结果，以产酸（颜色由红变黄）、产气者判为阳性。②MRHA试验。用天平准确称量3.8 g柠檬酸钠，加100 mL；蒸馏水配制成3.8%柠檬酸钠。分别采集豚鼠、鸡、兔、猪、羊等动物的血液，与3.8%柠檬酸钠以9∶1的比例分别制成抗凝血（或脱纤血），用生理盐水以1 000～2 000 r/min离心10 min，洗涤3～4次（上清液无色透明为止），并制备成3%（V/V）的红细胞悬液，4 ℃保存供试。接种标准菌株及分离株于改良Minca培养液中，37 ℃摇床培养24 h。离心菌液（8 000 r/min，5 min）。用生理盐水悬浮，洗3次，至上清液澄清为止。去上清，用适量的含1% D－甘露糖的生理盐水悬浮细菌。取少量670 nm调透光率到10%，定为基础菌悬液。参照房海[12]的方法进行操作。结果判定时以1∶4倍以上稀释菌液仍能呈现明显红细胞凝集（++）者判为阳性，并以仍能使红细胞呈现明显凝集（++）的菌液最高稀释倍数判为该菌株的血凝滴度（血凝效价）。③血凝抑制反应。取普通营养琼脂斜面（或半固体琼脂）培养物，用含1% D－甘露糖的生理盐水洗下菌苔并制备成适当浓度（50亿/mL）的菌悬液供试。用3.8%柠檬酸钠抗凝血（或脱纤血），用生理盐水低速离心洗涤3～4次（上清液无色透明为止），并制备成3%（V/V）的红细胞悬液供试。参照房海[12]的方法进行操作。结果判定时能使4 U（或8 U）菌毛抗原的血凝作用被抑制则判为阳性反应（＋），表明该血清中具有相应抗体或原凝集作用是特异的；反之为阴性反应（－）；以仍能呈现出明显抑制作用的血清最高稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度（抑制效价）。
　　2结果与分析
　　2.1病原菌分离鉴定
　　2.1.1分离纯化培养。病料接种于麦康凯琼脂平扳，于37 ℃温箱培养24 h后形成红色菌落，分离出56株大肠杆菌。涂片染色镜检为革兰氏阴性杆菌，无荚膜，无芽孢。
　　2.1.2生化鉴定。分离所得56株大肠杆菌的生化试验结果均符合大肠杆菌的生化特征：可水解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖；不分解尿素；还原硝酸盐；吲哚试验和MR试验均为阳性，柠檬酸盐、VP试验阴性。
　　2.2致病性
　　2.2.1死亡情况。接种2 h后即有小白鼠呼吸急促、精神不振、呆伏、被毛松乱。5 h之后开始有小白鼠死亡。小白鼠死亡情况见表1。由表1可知，接种后时间＜12 h时，死亡数为15只，毒力等级为强毒力；接种后时间为12~24 h时，死亡数为18只，毒力等级为中毒力；接种后时间为24~48 h时，死亡数为23只，毒力等级为弱毒力；接种后时间＞48 h时，死亡数为3只，毒力等级为微毒力。
　　2.2.2死亡鼠剖解变化。死亡小白鼠，剖解取其心、肝血划线接种于麦康凯培养基和普通营养肉汤。于37 ℃温箱培养24 h后，麦康凯琼脂平板分离到典型的大肠杆菌菌落，普通营养肉汤浑浊。
　　2.3大肠杆菌O抗原血清型鉴定
　　56株供检菌株中有33株定型，分属于11种血清型，以O149、O139、O8为优势血清型，这3种血清型的菌株数占已定型菌株的51.52%（17/33），另有23株未能定型，占分离株的41.07%（23/56）（表2）。
　　2.4大肠杆菌菌毛型鉴定
　　2.4.1棉籽糖发酵。标准菌株中除K88外，其他菌株均不能发酵棉籽糖。56株分离株中有37株呈阳性反应，占分离菌株的66.07%。发酵菌株中，发酵能力存在一定差异，从12～72 h不等。
　　2.4.2甘露糖抵抗血凝及血凝抑制试验。由表3可知，试验得到的各标准菌株的血凝谱比其他报道的更广泛，在一定程度上丰富了原有的血凝谱。同时发现在菌液浓度比较高的情况下，987P对兔、猪、鸡出现轻微的凝集现象。可能原因有：①甘露糖浓度低，不足以抵抗I型菌毛的凝集作用；②987P标准株同时也微弱表达了其他菌毛；③987P可能存在弱血凝性。
　　由表4可知，各标准菌株与其相应的抗血清均能发生血凝抑制反应，证明MRHI方法的可行性。而分离菌株中，棉籽糖发酵阳性株MRHA试验，有8株可以凝集鸡红细胞。MRHI试验表明：K88抗血清可以不同程度地抑制它们的血凝反应，K99及F41抗血清则不能。棉籽糖发酵阴性的菌株，在血凝试验中对兔血、猪血等表现血凝性，其中A58的血凝性最强，以A58做血凝抑制试验，K88、K99、F41抗血清均不能抑制其血凝反应。
　　3结论与讨论
　　根据细菌分离培养特性、生化鉴定结果以及动物致病性试验，证实该试验研究的分离菌株为引起仔猪断奶腹泻的致病性大肠杆菌。从患病仔猪肠内容物中分离出的56株大肠杆菌，致病性都很强。经试验分析，得到的各标准菌株的血凝强度与报道的存在一定的差异。大肠埃希氏菌的抗原类型主要由O、K、H抗原组成。O抗原是血清学分群的基础，每1株大肠埃希氏菌被认为只含有1种O抗原；大肠埃希氏菌的O抗原类群非常多，至今已发现173种之多[13]，但似乎仅有少部分与致病性有关。仔猪断奶腹泻大肠杆菌O血清型国外主要报道有：O108、O138、O141、O147、O157[14]；O138、O139、O141、O147、O157 O16、O108[15]；O8、O138、O139、O141、O147、O149、O157[16]。该试验中56株分离菌株中有33株定型，分属于11种血清型，以O149、O139、O8为优势血清型，这3种血清型的菌株数占已定型菌株的51.52%（17/33），另有23株未能定型，占供检菌株的41.07%（23/56）。
　　由于试验只采用了11种主要的致病性大肠埃希氏菌单因子抗O血清，分别为O8、O9、O20、O45、O64、O101、O138、O139 、O147、O149、O157。因此，得出的结果所覆盖的血清型必然不够完整，只包含了其中一部分常见的血清型。除与Hampson D J等的报道有一定的相似性外，与其他报道间存在一定的差异。这意味着不同地区ETEC的O优势血清型存在一定差异。
　　大肠杆菌菌毛类型很多，仔猪大肠杆菌菌毛有普通菌毛，K88、K99、987P、F41、F18等。其中编码大肠杆菌K88基因和发酵棉籽糖基因存在于同一质粒上，大肠杆菌K88+菌毛抗原株表现为发酵棉籽糖产酸产气，而K88-株一般不发酵棉籽糖，所以用棉籽糖发酵试验筛选猪腹泻病例中大肠杆菌K88+菌株，简便易行。王光荣等（1984年）[17]用玻片凝集反应、抗甘露糖血凝试验和棉籽糖发酵试验对K88+及K88-的标准菌株和分离菌株做了对比试验，结果证明K88+均能发酵棉籽糖产酸、产气。对标准株K99、F41、987P、K88做了棉籽糖发酵对比试验，发现只有K88菌株为阳性，说明了该方法的可靠性。试验中，53株供试菌株共有37株呈阳性反应，即K88阳性大肠杆菌有37株。说明K88为常见的菌毛类型之一，与报道[14-16]一致。
　　大肠杆菌各种菌毛在形态上非常相似，都能介导细菌黏附到肠上皮细胞；但是，它们不仅在血清学关系上各不相同，而且血凝谱也有一定差异[18]。根据血清学关系，K88菌毛被分为K88ab、K88ac、K88ad，3种血清型都能凝集豚鼠红血球。PARRY S H等[19]报道，K88ab还能对鸡红细胞表现MRMH活性，而另外2种血清型不能，该试验也得到了相同的结果。棉籽糖阳性分离株MRHI试验结果表明：K88抗血清可以不同程度地抑制它们的血凝反应，K99及F41抗血清则不能。但在棉籽糖阴性分离株MRHI试验中，K88、K99、F41抗血清均不能抑制其血凝反应，推测可能由于研究中采用的抗血清未包含F18等，分离的菌株属于其他的或者是新型的菌毛类型，具体可采用PCR等方法进一步研究。
　　PCR方法可从基因水平检测菌毛，不需要对细菌进行菌毛化培养，克服了有些菌株体外培养条件严格的限制。该方法操作简单、快速，对细菌培养物仅需3～4 h即可得出结果；具有很好的特异性和敏感性，10 cfu的细菌即能检出；对各检测菌株的检测结果与血清学反应的检测结果一致[20]。
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