木瓜蛋白酶固定化【固定化木瓜蛋白酶的研究】
时间：2019-01-09 03:33:00 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘 要： 近年来，国内外学者对固定化酶的载体和固定化方法进行了大量的研究，取得了一定的成果，有些成果已应用于工业生产。本实验直接利用包埋凝胶法，以海藻酸钠为载体，对木瓜蛋白酶的固定化条件，以及固定化酶的动力学性质进行了初步的研究。实验对载体的浓度、载体与酶的比例，以及固定化酶颗粒大小等诸方面对固定化酶的影响进行了比较。实验确定了固定化酶的最佳固定化条件。并对固定化酶的催化特性进行了初步的研究，测定了固定化酶的最适pH值，最适温度和米氏常数Km；同时还对固定化酶的热稳定性，固定化酶的酶活性等问题进行了研究。
关键词： 固定化 木瓜蛋白酶 酶活性
1.材料和方法
1.1材料
本实验所用的材料主要有海藻酸钠（化学纯，进口分装），木瓜蛋白酶（MERCK公司产品），氯化钙（化学纯），三氯乙酸（化学纯），酪蛋白（化学纯），等等。仪器主要有721型分光计，恒温槽，恒温搅拌机等。
1.2方法
1.2.1木瓜蛋白酶的固定方法
取一定量的木瓜蛋白酶溶于一定pH值的水溶液中，再加入适量的海藻酸钠，搅拌均匀，形成胶状体。静置一段时间至胶体中的气泡全部逸去，用胶头滴管吸取该胶体，在距离液面约20厘米的高度上，滴入高浓度的CaCl溶液中。滴入溶液中的胶体里含有海藻酸钠，会与氯化钙溶液中的Ca2+迅速反应，形成直径约为3毫米的凝胶珠。待反应一段时间后，凝胶珠沉淀下来，此时就可将凝胶珠捞出，置于冰箱中保存备用。
1.2.2酶活性的测定
1.2.2.1木瓜蛋白酶酶活性的测定
取一定量的木瓜蛋白酶干粉，溶于5毫升0.1N pH=6.8的巴比妥纳一HCl缓冲液中 ，在30℃水溶液中保温预热15分钟 ，加入同样预热的0.5%酪蛋白溶液5毫升 ，在30℃水浴中准确反应20分钟，立即加入5毫升 10%三氯乙酸溶液，以终止其反应。静置15分钟后过滤。同时作一对照管，即取同量的酶粉制成同样的酶液后，先加入5毫升 10%三氯乙酸，再加入0.5%酪蛋白溶液，在30℃水浴中准确反应20分钟，取出静置15分钟后过滤。取三支试管并编号，分别加入样品滤液，对照液和水各2毫升， 然后各加入斐林一酚试剂A5毫升 ，混匀后再加入0.5毫升斐林一酚试剂B，在30℃水浴中显色15分钟。在660钠米处以加水的管为空白测样液和对照液的光吸收值。
酶活性以在30℃，pH=6.8的条件下水解酪蛋白每分钟产生酪氨酸1微克作为一个酶活单位。
1.2.2.2固定化木瓜蛋白酶酶活性测定
以上述方法――斐林一酚法来测定固定化木瓜蛋白酶的酶活性。但不同的是在保温反应过程中应不断振荡试管，以避免酶促反应只在局部进行。
2.结果与分析
2.1固定化条件和选择
2.1.1不同pH值对固定化酶制备的影响。在实验时，选用pH在3.0到9.0的范围内不同pH值的缓冲液制备固定化酶并测定其活性。结果表明，pH值对固定化酶制备后的活性有影响，在微偏酸性时所制备的固定化酶的酶活性较高。这可能与载体海藻酸钠和木瓜蛋白酶的结构有关。
2.1.2不同温度对固定化酶制备的影响，在实验时，选用在5℃～60℃范围内取不同温度条件制备固定化酶，并测固定化酶的活性。结果表明，固定化酶的制备应在较温和的条件下进行，温度太高或太低都会使固定化酶的活性降低。实验表明，控制温度在10℃～30℃范围内制备固定化酶，其活性较高。
2.2固定化酶的催化特性
2.2.1最适pH值。取一定量的固定化酶，其他条件下不变，在pH值3.0～9.0范围内取不同pH值的缓冲液中用0.5%酪蛋白溶液为底物，在30℃保温反应20min后，测定它们的活性。结果表明，固定化酶的最适pH在6.5～7.0间。
2.2.2最适温度。取一定量的固定化酶，其他条件不变，以0.5%酪蛋白溶液为底物，在30℃～100℃范围内，每隔5℃振荡保温20分钟，然后测其活性。结果表明，固定化酶的最适温度为55℃～60℃，在温度为85℃时，仍具有较高的活性。由此可见，固定化酶可以在较高的温度条件下进行酶促反应。这可能是由于胶体颗粒的外层对颗粒内部的酶起保护作用。
2.2.3米氏常数Km值的变化。取相同量的固定化酶和可溶性酶在最适反应条件下，对不同浓度的酪蛋白溶液反应10分钟，求出酶促反应的速度。以反应速度和底物浓度作双倒数图，求出Km值。结果表明，固定化酶的Km值比可溶性酶的Km值高，这是由于经固定后，大部分酶包埋在胶体颗粒内部所致。
2.3固定化酶的热稳定性
取一定量的酶粉制成的溶液酶和含有同量酶的固定化酶分别在25℃～85℃范围内的不同温度下保温30分钟，冷却后在最适条件下测定酶活性，实验结果表明，固定酶在60℃以上，溶液酶在50℃以上处理30分钟，活力逐渐下降。
2.4可溶性酶溶液与固定化酶活性的比较
取一定量的酶粉制成的酶溶液与含有等量酶的固定化酶，在最适条件下分别测定其酶活性。实验结果表明，固定化酶的酶活性仅为酶溶液酶活性的35％～40%。随着胶体颗粒直径的减小，固定化酶的酶活性有所提高；这是由于经固定后，大部分的酶被包埋在胶体颗粒内部。因此，减小胶体颗粒的直径可提高固定化酶的活性。
3.讨论
目前，固定化酶技术已成为酶工程研究的重点和热点之一，广泛地应用于工业生产（如生产高果糖糖浆、氨基酸等）、生化制药（如生产抗生素、核酸、蛋白质、抗体、高纯度蛋白酶等）、生物传感器，以及环境保护（如生产葡萄糖氧化酶传感器、生活污水和工业废水中有害成分的吸附等）。
本实验采用海藻酸钠作为载体制作固定化酶是一种方法简单、操作简便、条件温和、制备效果良好的固定化方法。在实际操作过程中，具有稳定性能好、机械性能好、颗粒均匀，流速快，半衰期长等优点，可广泛地应用于各种饮料的抗混浊、抗沉淀等生产中。在本实验中，避免使用交联剂，减少酶活性在固定化过程中的损失，提高了固定化酶的利用效率。在生产实践中，作为载体的海藻酸钠胶体颗粒直径要取多少，才能使固定化酶既发挥较高的活性又有利于操作，还有待于进一步研究。
参考文献：
［1］肖海军，贺筱蓉.固定化酶及其应用研究进展.生物学通报，2001.
注：“本文中所涉及到的图表、公式、注解等请以PDF格式阅读”
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