【邻苯二酚和邻苯二醌与牛血清白蛋白的相互作用】血清白蛋白
时间：2020-03-18 07:19:39 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
摘要：［目的］ 探讨邻苯二酚、邻苯二醌与血清白蛋白的相互作用。［方法］ 在Na2HPO4 0.05 mol/L-NaH2PO4 0.05 mol/L-NaCl 0.10 mol/L缓冲溶液（pH 7.30）中研究牛血清白蛋白与邻苯二酚结合后在L-胱氨酸修饰金电极上的电化学行为。 ［结果］ 牛血清白蛋白与邻苯二酚结合后可使邻苯二酚的氧化峰峰电位正移、邻苯二醌还原峰电位负移，且峰电流减小，根据邻苯二酚、邻苯二醌和血清白蛋白结合的饱和度，计算邻苯二酚、邻苯二醌和血清白蛋白结合比分别为71:1和115:1。 ［结论］ 牛血清白蛋白与邻苯二酚以较强的氢键结合，邻苯二醌与血清白蛋白结合力较大。
关键词： 邻苯二酚；牛血清白蛋白；循环伏安法；相互作用
A Study on the Interaction between Pyrocatechol，O-Benzoquionone and Bovine Serum Albumen SONG Yuan-zhi1，2，XIE Ji-ming1* ，CHEN Song-tao1，CHEN Min1，WU Yun-long1（1.School of Chemistry & Chemical Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；2.Jiangsu Province Key Laboratory for Chemistry of Low-Dimensional Materials，Huaiyin Teachers College，Huaian 223300，China）
Abstract：［Objective］ To study the interaction between pyrocatechol，o-benzoquionone and bovine serum albumen. ［Methods］ The cyclic voltammetric（CV）behavior of pyrocatechol and conjoint pyrocatechol with bovine serum albumen at L-cysteine modified golden electrode in 0.05 mol/L Na2HPO4-0.05 mol/L NaH2PO4-0.10 mol/L NaCl buffer solution（pH 7.30）was studied. ［Results］ The peak of conjoint pyrocatechol with bovine serum albumen shifts to positive，the peak of conjoint o-benzoquionone with bovine serum albumen shifts to negative，and its peak current decreases. According to the saturation of respective conjoint pyrocatechol and o-benzoquionone with bovine serum albumen，the conjoint rate of hydroquinone and o-benzoquionone with bovine serum albumen is 71 : 1 and 115 : 1 respectively. ［Conclusion］ The interaction between pyrocatechol and bovine serum albumen is ascribed to hydrogen bonding，and interaction force between o-benzoquionone and bovine serum albumen is bigger than that between pyrocatechol and bovine serum albumen.
Key Words：pyrocatechol；bovine serum albumen；cyclic voltammetric（CV）
蛋白质是生物体的基本组成成分，如酶、抗体、转运蛋白等在生物体内发挥着重要功能。人血清白蛋白存在于血液中，相对分子量为66 241，等电点为4.7［1］，主要维持血浆的胶体渗透压，其另一功能是与许多微溶于水的物质结合为易溶于水的复合物。邻苯二酚广泛用于化工行业，对环境污染极为严重，在环境中容易氧化为邻苯二醌。邻苯二酚与邻苯二醌是通过人血清白蛋白转运进入人体各器官的，可以和DNA碱基形成加合物［2-4］，对人体危害极大。因此，研究血清白蛋白与邻苯二酚及其氧化产物邻苯二醌的相互作用具有重要意义。本项目利用循环伏安法研究邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为，并初步探讨牛血清白蛋白与邻苯二酚及邻苯二醌相互作用的机理。
1内容与方法
1.1仪器与试剂
缓冲液：0.05 mol/L Na2HPO4-0.05 mol/L NaH2PO4-0.10 mol/L NaCl缓冲溶液（用NaOH调pH）；50 g/L L-半胱氨酸；0.1 mol/L H2SO4；2.000 0 g/L邻苯二酚；20.000 0 g/L牛血清白蛋白。
MEC-12B型多功能微机电化学分析仪（江苏电化学分析仪器厂）；金电极（直径1 mm）为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极。
1.2实验内容
1.2.1 L-半胱氨酸在金电极上组装
由于L-半胱氨酸金电极制备容易，重现性好，且具有氨基酸基团，可以方便解释氨基酸基团与酚的相互作用，故选择L-半胱氨酸金电极作为工作电极。L-半胱氨酸金电极制备：金电极置于粒径为0.05 μm Al2O3粉末中反复抛光至镜面，再用Microcloth抛光布上抛光光亮，再用丙酮冲洗，用亚沸水超声波清洗。然后将金电极置于H2SO4 0.1 mol/L中2 V氧化5 s，-0.35～1.5 V以1 V/s循环扫描5次，取出金电极，用蒸溜水冲洗干净，用磁力搅拌器在蒸溜水中清洗5 min，将清洁后的金电极置于50 g/L的L-半胱氨酸中浸泡24 h，取出金电极，再用蒸溜水冲洗干净，磁力搅拌器在蒸溜水中清洗5 min，即得L-半胱氨酸修饰金电极。所用水为三次亚沸蒸溜水。
1.2.2电化学行为 在5.00 ml容量瓶中，加入0.10 ml邻苯二酚，5.00 ml 0.05 mol/L Na2HPO4-0.05 mol/L NaH2PO4-0.15 mol/L NaCl缓冲溶液，混匀，作循环伏安扫描。
1.3 量子化学计算
邻苯二酚与邻苯二醌用半经验方法（AM1）进行分子几何构型初始优化，然后用密度泛函理论（DFT）在6～31 G（d）水平进行全优化分子结构，在相同水平计算分子的分子前线轨道能量及静电荷。所有计算在Gaussian 03软件包中完成。
2 结果
2.1 L-半胱氨酸修饰电极的电化学行为特征 修饰电极于-0.60～0.8 V范围内的循环伏安图，裸金电极上未见氧化还原峰存在； L-半胱氨酸修饰电极在低电位的电流减小，在-0.068 V产生一个极小的氧化峰，这可能是羧基在较低的电位下被还原为羟基所致。
2.2 邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极上的电化学行为
当溶液酸碱度为pH 7.30时，0.040 0 g/L邻苯二酚在裸金电极（图1a）于100 mV/s循环扫描时产生一个氧化峰（Epa= 0.312 V），峰电流ipa为1.155 μA，于0.012 V产生一个峰电流（ipc）为0.706 μA的还原峰（Epc），ipa/ipc=1.636；在L-半胱氨酸修饰金电极上，氧化峰（Epa）为 0.245 V，比裸金电极负移了0.067 V，峰电流ipa为1.319 μA，于0.085 V产生一个峰电流（ipc）为1.037 μA的还原峰（Epc），比裸金电极正移了0.073 V，ipa/ipc=1.272，说明邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极可逆性变好，峰电流变大，对邻苯二酚的氧化还原具有催化作用。
2.3扫速对邻苯二酚峰电流和峰电位的影响
邻苯二酚在裸金电极上的氧化还原峰电位随着扫速的增大氧化峰电位发生正移，还原峰负移，峰电流（ip）与扫速的平方根（V1/2）成正比，说明峰电流受扩散控制；邻苯二酚在L-半胱氨酸修饰金电极上的氧化还原峰电位受扫速的影响与裸金电极相似，但负移的幅度较小，峰电流（ip）与扫速的平方根（V1/2）成正比，说明峰电流也受扩散控制。
2.4 牛血清白蛋白对峰电位与电流的影响
由于牛血清白蛋白容易被吸附到金电极上，故在修饰电极上研究了牛血清白蛋白在pH 7.30溶液中对邻苯二酚氧化还原电位及电流的影响。
从图2可以看出牛血清白蛋白加入到邻苯二酚溶液时，其氧化峰电位发生正移，但峰电流变小，说明牛血清白蛋白对邻苯二酚向电极扩散的影响较大；而对其氧化产物邻苯二醌，其氧化峰电位发生负移，峰电流变小，说明牛血清白蛋白对邻苯二醌的扩散的影响也较大。
图3为牛血清白蛋白与邻苯二酚氧化峰电流的关系，当牛血清白蛋白的质量浓度达到0.340 0 g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与邻苯二酚结合达到饱和状态。
图4为牛血清白蛋白与邻苯二醌氧化峰电流的关系，当牛血清白蛋白的质量浓度达到0.2200 g/L时，峰电流不再改变，说明牛血清白蛋白与邻苯二醌结合达到饱和状态。根据苯二酚与邻苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量计算出苯二酚与邻苯二醌和血清白蛋白的结合比分别为71:1和115:1。
2.5 邻苯二酚与邻苯二醌的量子化学计算结果
邻苯二酚与邻苯二醌所有原子都在一个平面内，邻苯二酚的最大净电荷为0.32，最小的负电荷为-0.26，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为0.008 07和-0.206 65 Hartree，分子的偶极距为2.518 7，为极性分子；邻苯二醌的最大净电荷为0.38，最小的负电荷为-0.42，最低空轨道和最高占有轨道能量分别为-0.131 85和-0.249 38 Hartree，分子的偶极距为5.338 1，为极性分子；分子的净电荷反映了分子间净电吸引的能力；最低空轨道能量越低，越容易接受电子，最高占有轨道能量越高越容易提供电子，故分子的前线轨道反映了形成分子氢键的能力。由此来看，邻苯二醌比邻苯二酚具有较大的净电吸引的能力和形成分子氢键的能力，从图4和图5可以看出邻苯二醌在电极上峰电位和峰电流改变较大。
2.6 邻苯二酚、邻苯二醌与血清白蛋白作用机制探讨
L-半胱氨酸的pKa1和pKa2分别为1.96和10.28［5］，当酸碱度为pH 7.30和11.00时，NH3+-C（R）OOH、NH3+-C（R）OO-、NH2 -C（R）OO-的分布分数按下列公式计算：a1=［H+］2/（［H+］2 +ka1［H+］+Ka1Ka2），a2=Ka1［H+］/（［H+］2+ka1［H+］+Ka1Ka2），a3=Ka1Ka2/（［H+］2+ka1［H+］+Ka1Ka2），pH 7.30，a1=0.000，a2= 1.000，a3=0.000
可见，在pH
3 讨论
人血清白蛋白是由氨基酸组成的生物大分子，其表面有大量的氨基酸残基，与L-半胱氨酸具有相似的结合方式。参照人血清白蛋白等电点为4.7，氨基酸残基主要以NH3+-C（R）OO-存在，牛血清白蛋白与邻苯二酚和邻苯二醌在溶液中的结合，与邻苯二酚和邻苯二醌在电极上的表现有所差异，邻苯二酚和邻苯二醌与血清白蛋白结合后，电极为了破坏这种氢键作用力，必须提供更高的氧化电位和较低的还原电位，这种作用力越强，电位偏离越远，同时强烈的作用将进一步导致复合物扩散系数变小，电流变小。本研究结果表明邻苯二醌与牛血清白蛋白的结合力强于邻苯二酚。
量子化学计算和电化学结果表明，邻苯二酚和邻苯二醌可以和血清白蛋白形成较强的氢键，且邻苯二醌和血清白蛋白的作用力要大于邻苯二酚的作用力。根据邻苯二酚和邻苯二醌可以和血清白蛋白结合的饱和度及血清白蛋白的分子量计算邻苯二酚、邻苯二醌与血清白蛋白结合比分别为71 : 1和115 : 1。
参考文献：
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张昌颖.生物化学［M］.第2版.北京：人民卫生出版社，1985：15.
（收稿日期：2006-06-02）
（英文编辑：黄建权；校对：徐新春）
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