昆虫抗冻蛋白基因的克隆与表达研究进展:抗冻蛋白基因

　　摘要　产生抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)是许多昆虫抵御寒冷的一种重要机制。昆虫抗冻蛋白基因的克隆和表达是研究抗冻蛋白活性和功能的主要途径。文章归纳GenBank所登录的昆虫抗冻蛋白基因及其特点，总结昆虫抗冻蛋白基因的天然表达和基因工程表达方面尚未明确或需要克服的一些问题。目前在GenBank注册的昆虫抗冻蛋白基因约100个，集中于9种昆虫隶属鞘翅目3个科和鳞翅目1个科。昆虫抗冻蛋白基因具有多拷贝和多同种型(isoforms)的特点。昆虫抗冻蛋白的天然表达具有物种间和同种型间的多样性。基因工程表达昆虫抗冻蛋白需要克服表达量低活性不高的问题。对昆虫抗冻蛋白表达规律的研究有助于全面认识其功能。
　　关键词 昆虫抗冻蛋白，基因克隆，结构分析，表达规律，鳞翅目，鞘翅目
　　
　　昆虫在生长发育过程中，不可避免地要遭受不利气候的影响，譬如酷夏、严冬。为了保护自身不受外界环境的伤害，产生抗冻蛋白(antifreeze protein，AFP)是许多昆虫的一个重要的越冬策略。抗冻蛋白又称热滞蛋白(the Fmal hysteresis protein，THP)是20世纪60年代首先从北极海鱼的血淋巴中分离出的一种蛋白质。抗冻蛋白能非依数性地(non―couigative)降低溶液的冰点，但对其熔点影响甚微，由此产生熔点与冰点之差，叫做热滞活性(thermalhysteresis activity，THA)。非依数性是指冰点的降低决定于AFP的性质而非溶液中分子的数量。抗冻蛋白的热滞效应可以极大地抑制冰晶的生长。此外，抗冻蛋白还能够改变冰晶形态、抑制重结晶，从而有效地保护生物有机体免受冰冻伤害。目前已从鱼类、昆虫、植物和细菌中发现多种抗冻蛋白。在自然选择和平行进化作用下，这些蛋白质结构呈现多样性。同时不同物种间抗冻蛋白热滞活性的大小差异很大，其中昆虫抗冻蛋白的热滞值最高(3～6℃)，鱼类(O.7～1.5℃)，植物抗冻蛋白的热滞值最低(O.2～0.5℃)。
　　Duman等分别检测了生活在美国阿拉斯加州的75种昆虫和6种蜘蛛的血淋巴，在18种昆虫和3种蜘蛛中检测到了热滞活性，这说明抗冻蛋白在昆虫中是比较普遍存在的。
　　
　　1 昆虫抗冻蛋白基因的克隆
　　
　　早在20世纪60年代第一次在黄粉虫中发现热滞活性以来，已经从多种陆地节肢动物中分离出抗冻蛋白，包括蜘蛛spiders、螨mitests、蜈蚣centipedes，北极鳞翅目Embryonopsis muhicellular，长角牛甲虫Phagium inquisitor，蛾moths，松针瘿蚊Thecodiplosis japonensis，美洲脊胸长椿Oncopehus fasciatus以及黄粉虫Tenebdomolitor，赤翅甲Dendroides eanadensis，云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana等。但是目前对昆虫抗冻蛋白的研究集中在黄粉虫、赤翅甲、云杉卷叶蛾等为数不多的几种昆虫。到目前为止，在GenBank注册抗冻蛋白基因的昆虫种类还很有限(表1)，且主要集中在鞘翅目的拟步甲科Tenebrionidae、赤翅甲科Pyrochroidae、锹甲科Lucanidae和鳞翅目卷叶蛾科Tortrieidae。
　　对黄粉虫抗冻蛋白及其基因的研究主要由加拿大Queens大学的Peter Davies小组开展。1997年他们从黄粉虫幼虫的血淋巴液中以毫克级分离到了一种8.4 kDa的蛋白(TmAFP)，其热滞活性是鱼类抗冻蛋白的10～100倍。氨基酸测序之后，设计简并的核酸引物，利用liT，PCR扩增得到AFP的4个cDNA克隆。TmAFP富含Cys、Thr和Ser，其序列特点是串联重复12，氨基酸序列TCTxSxxCxxAx，细菌表达的融合蛋白获得了很高的TH活性。1999年，他们通过分离黄粉虫幼虫血淋巴液获得纯化的AFP，热滞活性达到5.5°。从幼虫脂肪体为材料构建的cDNA文库克隆到17个cDNA克隆，编码9个不同的AFP，成熟肽的同源性为86％。
　　对赤翅甲抗冻蛋白(DAFP)的研究主要由美国Notre Dame大学的Duman小组开展。1998年他们报道了利用DAFP抗血清在10月份采集幼虫构建的cDNA表达文库中筛选出10个序列不同的克隆，编码3个序列不同大小为7.4～8.7 kDa的多肽。DAFP与TmAFP的氨基酸相似性为40％～66％，有相同的12-氨基酸的串联重复序列。1999年Duman小组又报道从12采集幼虫构建的cDNA文库中克隆出13个不同的DAFP，其中有9个是新的，它们在氨基酸水平有较大变异，但仍具有12-氨基酸的串联重复序列。
　　对云杉卷叶蛾抗冻蛋白及其基因的研究主要由加拿大Queens大学的Virginia Walk和PeterDavies小组开展。2000年，他们报道了以云杉卷叶蛾在4℃滞育3个月的2龄幼虫构建的cDNA文库中筛选出AFP(CfAFP)，根据3’UTR的长短分为长、中长和短3种不同的异构体，CfAFP也富含Cys、Thr和Ser，富含二硫键，但与鞘翅目昆虫AFP没有同源性。具有15个氨基酸的串联重复，其中具有“TXT”基序，在抗冻蛋白与冰结合方面可能发挥作用。2002年，Doucet等又报道了更多的CfAFP异构体，其中Afo-Lul编码约9 kDa、Afp-Iul编码约12 kDa的AFP。两者都有3～3.6 kb的内含子，这在鞘翅目AFP中没有发现。
　　2005年，赵干、马纪等人根据已报道昆虫抗冻蛋白基因设计了保守区引物，通过RACE技术获得了编码23种新疆荒漠昆虫小胸鳖甲Microdera punctipennis抗冻蛋白(MpAFP)的cDNA。推导的氨基酸序列分析表明MpAFP具有规则的TCTXSXXCXXAX重复序列，与鞘翅目其他昆虫抗冻蛋白(如黄粉虫YL-3)序列具有66％～79％的相似性(图1)。大肠杆菌表达的融合抗冻蛋白具有很高的热滞活性。随后他们又从新疆荒漠甲虫洛氏脊漠甲Pterocoma loczyi、戈壁琵琶甲Blaps kashgarensis、光滑鳖甲Anatolica polita等鞘翅目昆虫克隆到抗冻蛋白基因，与黄粉虫AFP具有61％～80％的相似性。
　　从不同生物获得的抗冻蛋白基因都具有多拷贝性，昆虫AFP基因家族具有成串排列现象。AFP基因的这种排列方式为基因通过非等位重组(unequal recombination)的扩展和紧缩提供了机会。有人提出AFP基因拷贝数是环境(主要是温度变化)选择压力适应的结果，TmAFP基因重复单位的存在是其多样 性的基础，通过不等重组或复制性剪接(replicational slippage)等方式产生了重复数不等的基因。抗冻蛋白基因的这一特点可能与适应环境变化有关。
　　
　　2昆虫抗冻蛋白结构研究
　　
　　越冬昆虫与鱼类相比，面对更为严峻的冰冻威胁，故其体内AFP比鱼类AFP抗冻活性更高。虽然第一个昆虫抗冻蛋白在30年前就从黄粉虫中分离出，但是目前为止只有3种昆虫的抗冻蛋白结构被进行了详细研究，主要是黄粉虫、云杉卷叶蛾Choristoneura fumiferana和赤翅甲Dendroides canadensis，其物理性质总结于表2。
　　昆虫抗冻蛋白的分子量大都在7～20 kD之间，以系列同工型(isoforms)发生。黄粉虫AFP(Tenebrio molitor，TmAFP)为8.4～13 kDa的右手p螺旋，即螺旋本身是p片层结构，每一圈由12个氨基酸(TCTXSXXCXXAX)组成，共6～10个螺圈不等。TmAFP富含半胱氨酸(19tool％)和苏氨酸(21 m01％(26 mo|％)，有12个氨基酸的重复单位CTxSxxCxxAxT。8个二硫键分布在螺旋内侧，赋予该分子一定的刚性结构。氨基酸TCT基序重复出现在每个螺圈中，这种特殊的结构赋予昆虫抗冻蛋白极高的热滞活性。
　　赤翅甲抗冻蛋白(DAFP)包括几种同工型，其中研究较清楚的DAFP―1和DAFP-2，分子量约8.7 kDa，分别含83和84个氨基酸残基。它们组成7个含12或13氨基酸残基的重复单元(cTxSxxCxxAxTx)。每个重复单元中第l与第7个半胱氨酸都形成二硫键，共8对二硫键，其中7对二硫键位于重复单元内，1对位于重复单元之间，这8对二硫桥赋予其二级结构稳定性。在25℃时有46％8折叠，39％转角，2％螺旋，13％无规则结构。当遇到冰时b折叠和转角增多而转角和无规则结构减少。
　　云杉卷叶蛾(sbwAFP，或CfAFP)抗冻蛋白富含丝氨酸和苏氨酸，分子量9 kDa，与任何甲虫鱼类及植物AFP都没有序列同源性。其成熟肽具有90个氨基酸，8个半胱氨酸形成4个二硫键。SbwAFP的活性是鱼类AFP的10～30倍。核磁共振研究揭示SbwAFP的结构是左手B螺旋，每一转有15～17个氨基酸形成一个富含Thr的面，这个平面可能是与冰结合的面。CfAFP的一种同工型CfAFP-501，分子量12 kDa，具有极高的热滞活性。它比CfAFP多出2个螺环。多出的这2圈上同样具有Thr-X-Thr基序，它的热滞活性比鱼的高出10～100倍。
　　另外，近几年来研究人员对准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白和雪跳蚤抗冻蛋白也进行了详细的研究。准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白(MpAFP)富含半胱氨酸、苏氨酸、丙氨酸和天冬氨酸，分子量为10 kDa。三级结构是由7个重复序列(TCTXSXXCXXAX)组成的特殊的右手8，螺旋结构，即螺旋含有B片层。螺旋共7圈，每一圈由12个氨基酸组成。这些螺旋片段的空间取向一致。在B，螺旋的一个侧面上，规则排列着由保守的TCT形成的B折叠片层结构形成AFP的冰晶结合面。每一螺旋之间由1个二硫键连接，从而起到稳定蛋白结构的作用。
　　雪跳蚤Hypogastrura harveyi抗冻蛋白富含甘氨酸，分子量6.5～15.7 kDa。热滞值与已报道的DcAFP类似，HhAFP有多个GGX基序构成，由于4个脯氨酸的存在这些重复的基序形成了规则的B一螺旋结构，蛋白因而折叠成了交互平行和反平行的结构。二硫桥和氢键赋予了HhAFP一定的稳定性。有趣的是这些偶数个的螺旋结构共同形成了一个扁平的疏水表面，这个平面被认为是与冰的结合面，但至今没有科学的实验证明。2008年Pentelute等人通过对HhAFP的晶体结构的解析证实了雪跳蚤抗冻蛋白的结构模型，有关HhAFP方面的研究正在进行中。
　　
　　3昆虫抗冻蛋白基因表达规律的研究
　　
　　从目前的研究结果来看，抗冻蛋白基因的表达并非完全是我们所认为的温度越低表达量越高，这一点很令人感兴趣。Andorfer在研究赤翅甲AFP的表达时，发现热滞活性的总趋势是秋季(10月中旬)升高，冬季(12月底)达到高峰，冬季末(3月)开始下降。Northern检测AFP的转录水平也有大体相同的趋势，但是在深冬季节(1月和2月)转录水平相对较低，而此时蛋白水平却非常高。作者解释转录与蛋白水平的不一致可能是因为在冬季最冷的季节蛋白的半衰期很长，因此不需要DAFP的持续表达。还有一种可能是，转录水平检测的是DAFP一1，而在深冬季节还有其他异构体与DAFP-1一道引起热滞活性。分析发现基因dafp1和dafp7在不同季节有差异表达。dafp-1的表达受季节温度调节，在夏季样本中未检测到，而dafp-7在夏季样本中却有较高表达，由此推断dafe-7还有其他功能。
　　Graham等对黄粉虫AFP在整个发育过程中和不同低温处理后的表达情况进行了研究。发现在适宜的生长条件下，小幼虫(11～13 mg)只有低水平的AFP或转录物，但是同样条件下最后一龄幼虫(>190 mg)却分别增加lO倍和18倍。低温对各龄幼虫抗冻蛋白的表达在转录和蛋白水平都有促进作用，且转录水平的增加大于蛋白水平。在蛹阶段，AFP的转录水平很低，但热滞活性降低得很慢，低温不能逆转这种降低。此外，意想不到的是短日照光周期和完全黑暗对AFP的蛋白水平和转录水平都没有影响。由此他们提出发育停滞是调节黄粉虫AFP表达的主要因素。
　　Doucet等研究cfAFP基因的转录时发现，hfp-Lul和Afp，Iul在冬季的积累最高，但是2.7a的转录物只在夏季出现的1龄幼虫中检测到。这一结果表明云杉卷叶蛾AFP的差异表达是由发育阶段调节的而不是季节性低温调节的。在此基础之上，Amir等研究了云杉卷叶蛾AFP在夏季幼虫6龄幼虫的表达情况，发现也能检测到低水平RNA和蛋白的表达。原位杂交进一步证明在6龄幼虫的肠道有AFP的mRNA存在。对夏季表达转录物的测序表明这是一种在2龄幼虫eDNA文库没有出现的异构体，虽然该基因(命名为CfAFP6)与冬季表达的AFP的eDNA相似，但是有2个半胱氨酸被替代，大肠杆菌表达的CfAFP6没有热滞活性，即使以Cys做恢复代换也不没有热滞活性。因此，这种AFP在冬季2龄幼虫中不出现。
　　作者对2006年、2008年采样的小胸鳖甲进行了抗冻蛋白的表达规律研究，利用荧光定量PCR技术测定AFP的转录水平。对2个异构体MpAFP698和MpAFPl49的测定发现，两者的表达水平在不同季节变化不一致，但在夏季6～7 月份都有表达。在2006年的采样中，MpAFP698在夏季的相对表达量与11月份相当为2，而MpAFPl49在春季和冬季的相对表达量为3.5左右，夏季约为1。在2008的采样中，MpAFP698在冬季达最高值4，而MpAFP149在夏季的表达量与冬季接近，为2.8左右。昆虫抗冻蛋白在夏季的持续表达很值得进一步研究。
　　总之，昆虫抗冻蛋白AFP由于存在众多的异构体，加之昆虫的发育阶段和虫态不同以及受环境条件的影响而变得十分复杂。相似性很高的异构体为什么在不同的季节表达特征不同，或是在不同的发育阶段表达不同都是令人感兴趣的问题，抗冻蛋白除了与冰结合抑制冰晶生长的作用之外是否还具有其他功能都是需要深入研究的问题。
　　
　　4 昆虫抗冻蛋白生物学活性研究
　　
　　冬季某些昆虫血淋巴的热滞活性为3～6℃，最高达到8―9℃，明显高于鱼血清的热滞活性(1―2℃)。早期有人认为在昆虫体内的AFP活性很高，在重组表达和纯化出这种蛋白之前，人们对其特殊活性并没有引起重视。虽然昆虫血淋巴中的热滞活性较高，但纯化后的抗冻蛋白热滞活性明显降低。纯化的抗冻蛋白即使在较高浓度下，仍低于血淋巴的热滞活性。在赤翅甲抗冻蛋白水溶液中加入抗血清，其抗冻蛋白的活性可增加3倍。甚至在不能检测热滞活性的低浓度抗冻蛋白中加入适量抗体，也能使热滞活性升至1.5～2.5℃。上述现象说明昆虫血淋巴中可能存在另外一些可以与抗冻蛋白结合的物质，从而大幅度提高其活性。这类蛋白可称为抗冻蛋白的活化蛋白，目前已在赤翅甲中发现这种蛋白质。Duman等发现热滞活性为1.6℃的赤翅甲抗冻蛋白，当加入一种从血淋巴中分离出来、本身无热滞活性的70 kD的蛋白质后，抗冻蛋白的活性增加至5.24℃，但加入一般蛋白质无此效果，所以目前认为70 kD就是抗冻蛋白的内源活化蛋白。这种专一性活化蛋白的发现开辟了关于热滞活性调节机制研究的新领域，研究认为热滞活性是抗冻蛋白与活化蛋白共同作用的结果。某些昆虫体内分子量较大的冰核蛋白，也显示出轻微的活化作用。此外，一些小分子量的物质也能提高昆虫抗冻蛋白活性。
　　然而，体外昆虫抗冻蛋白在没有活化蛋白作用下其热滞活性仍远高于鱼类抗冻蛋白。浓度为20／zmol／L的云杉卷夜蛾AFP能够降低冰点1.08℃，而美洲拟鲽鱼winter flounder的I型AFP在浓度到达400 mol／L时，仅降低O.27℃的冰点。黄粉虫AFP浓度为20 mol／L时能降低1.4℃的冰点，而III型鱼类(ocean pout)AFP的浓度为其100多倍(2.8 mol／L)时才降低相同的冰点。这些差异既存在于分离的天然AFP中，也存在于纯化单一成分的重组AFP或合成AFP中，因此排除了在体外昆虫AFP活性的提高是由于其他成分加入的解释。在活性上所形成的这种巨大差异很让人费解，还没有一个机制能说明2个不同类型AFP的作用原理。
　　在抗冻蛋白热滞活性与其浓度方面，用黄粉虫抗冻蛋白的抗体与含不同浓度该蛋白的昆虫体液进行Western杂交，结果表明热滞活性与抗冻蛋白的浓度之间呈双曲线型关系，并发现在曲线的斜率变化最大处的浓度与昆虫体内抗冻蛋白的生理浓度非常吻合，说明昆虫体内抗冻蛋白浓度较小的改变就会对其热滞活性造成较大的影响。
　　
　　5昆虫抗冻蛋白的基因工程表达
　　
　　抗冻蛋白在改善冻融食品的质量和产品的储存方面具有潜在的应用价值。此外，融合抗冻蛋白在疾病治疗如器官、组织、细胞等的低温保存等方面也有着潜在的重要性。任何一方面的应用都需要大量的活性抗冻蛋白。由于昆虫抗冻蛋白独特的结构和生物学活性(小分子量，众多的异构体)给分离纯化天然昆虫抗冻蛋白带来一定的难度。通过基因工程技术已对少数昆虫抗冻蛋白进行了表达和纯化。由于高活性的昆虫抗冻蛋白8一螺旋结构的正确折叠需要众多二硫键的参与，因而细菌表达系统中往往不能表达具有活性的正确构象的昆虫抗冻蛋白或者是产生不可溶性的包涵体蛋白，这类蛋白必须经过变性、复性、氧化和重折叠过程之后才能获得有活性的正确折叠的抗冻蛋白，而且该过程往往需要较复杂的纯化方法。最近几年多种表达载体和宿主菌被用来表达昆虫抗冻蛋白，于此同时，酵母表达系统也被用来表达富含二硫键的昆虫抗冻蛋白。但是到目前为止还没有活性抗冻蛋白的高产表达系统。因此采用基因工程技术获取昆虫抗冻蛋白仍是需要解决的问题。
　　
　　6抗冻蛋白的应用及其展望
　　
　　由于昆虫抗冻蛋白比植物和鱼类抗冻蛋白有较高的热滞活性。因此可以充分利用昆虫抗冻蛋白的这一特点应用于农业、医学以及食品工业等领域。抗冻蛋白可抑制蔬菜冷冻贮藏过程中冰晶的重结晶，在食品的冷冻、储藏、运输和解冻过程减少细胞损伤从而提高冷冻食品的质量。同时抗冻蛋白可用于卯、精子、胚胎或肝脏等器官的超低温保存，改善其冷冻质量。
　　另外，通过基因工程将抗冻蛋白的基因转入抗冻性差的植物体内，使其产生抗冻蛋白进而提高抗冻耐寒能力，不仅能增强作物在田间的抗寒能力，而且可改善作物在收获后的贮藏加工特性。Wallis，Culter，Kenward，Lee，Holmberg等人通过基因工程技术分别将抗冻蛋白基因导入不同植物中，获得了有一定抗冻能力的植株。2002年Huang等人将赤翅甲抗冻蛋白基因成功导入拟南芥中并在转基因株系细胞提取物中检测到具有热滞活性的抗冻蛋白的表达。2008年wang等人通过农杆菌浸染法成功将准噶尔小胸鳖甲抗冻蛋白基因导人烟草中，耐寒性实验证明转基因烟草的抗寒能力得到了加强。
　　虽然昆虫抗冻蛋白的研究取得了很大的进展，但昆虫抗冻蛋白的结构与功能、基因表达规律、体外重组表达等仍需进一步研究，以便为昆虫抗冻蛋白的应用奠定坚实的基础。随着研究的不断深入，相信昆虫抗冻蛋白必将在农业、医学和食品科学等领域具有更加广阔的应用前景。

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