响应面法优化槲皮素纳米粒的制备工艺
时间：2023-06-07 17:35:13 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
秦治国，刘涛
(青岛科技大学 化工学院，山东 青岛 266042)
槲皮素作为八角[1-2]等天然调味品中的一种黄酮类化合物(总黄酮含量约占13.3%)具有多种生物活性，例如抗病毒、抗炎、抗氧化、抗冠心病、抗糖尿病、调节免疫力、抗癌等[3-4]。由于槲皮素具有较好的抗氧化性，因此可作为天然的抗氧化剂应用在食品及医药等方面。但是，槲皮素水溶性差的特点严重限制了槲皮素活性的发挥及应用[5]。
纳米混悬液是指活性成分和表面活性剂形成的胶体分散体系，颗粒粒径范围为1～1000 nm[6]。纳米混悬液的制备通常采用自上而下(如研磨或高压均质)和自下而上(如抗溶剂沉淀)的方法[7]。固体分散体是原料与载体介质(PVP、PEG和HPMC等)中所形成的分散体系[8]，具有改善溶解度和提高溶解速率的特点[9-10]，通常采用冷冻干燥、淬火冷却、喷雾干燥或旋转蒸发等技术。近几十年来，固体分散体技术被用于保健食品领域，极大地提高了动植物提取物中活性成分的溶解度、稳定性、疗效等，具有广阔的应用前景[11]。
本研究采用响应面法对压力、循环次数和浓度3个影响因素进行因素水平设计，优化了八角提取物中槲皮素纳米粒的制备工艺参数，减少了实验的次数。采用两步法(固体分散体结合高压均质技术)制备了槲皮素纳米粒，旨在改善槲皮素溶解度差的问题，以提高槲皮素的抗氧化能力、延长食品的保存时间并改良食品的味道。
1.1 材料
槲皮素：上海阿拉丁生化科技有限公司；
PVP-K30：广东粤美化工有限公司；
无水乙醇：天津富宇化工有限公司。
1.2 设备
高压均质机 ATS工程有限公司；
旋转蒸发仪 上海石亨仪器设备有限公司；
Zetasizer Nano ZS粒度测试仪 英国马尔文仪器有限公司；
超声仪 无锡杰瑞安仪器设备有限公司；
RC-6溶出仪 天津天光仪器有限公司；
Rigaku D/max 2500 X射线衍射仪 日本株式会社理学公司；
720N紫外可见分光光度计 上海精科实业有限公司；
差示扫描量热仪 德国耐驰仪器制造有限公司。
2.1 槲皮素固体分散体的制备
将槲皮素和PVP-K30 (2∶1)分别放入50 mL的无水乙醇中，超声至溶液变澄清。将得到的溶液放入旋转蒸发仪中快速干燥，设置温度为50 ℃和转速为100 r/min。
2.2 粉末X射线衍射(PXRD)
使用Rigaku D/max 2500 X射线衍射仪对槲皮素和槲皮素固体分散体进行表征。工作电压和电流分别保持在40 kV和20 mA。扫描参数设置为0.02°/s，步长为5°～40°(2θ)。
2.3 差示扫描量热法(DSC)
准确称量槲皮素和槲皮素固体分散体，分别放置在带有穿孔盖的40 μL铝锅中加热。在设定温度范围(30～340 ℃)内，以10 ℃/min的速率加热样品，并使用空白铝锅作为参考。
2.4 纳米粒的制备
通过高压均质法(HPH)制备浓度为1%槲皮素的纳米晶体。取槲皮素和槲皮素固体分散体分别分散在75 mL溶液中，该溶液中含有1%的PVP-K30。使用超声仪进行30 s的超声处理，使其分散均匀。高压均质机压力设置为1300 bar，在经过20个均质化循环后获得槲皮素纳米粒。
2.5 光子相关谱法(PCS)
使用Zetasizer Nano ZS粒度测试仪在25 ℃下测量样品的平均粒径和多分散指数(PDI)。将20 μL纳米悬浮液分散在1.5 mL水中稀释制备测试样品，每次测量3次。
2.6 体外的溶出实验
根据《中国药典》，在RC-6溶出度测试仪中采用桨法对槲皮素、槲皮素固体分散体以及它们的纳米粒进行溶出度测量。桨速为100 r/min，温度保持在(37±0.5) ℃，将样品(含有5 mg槲皮素)分别加入到900 mL纯水溶解介质中，分别在预定的时间抽取5 mL溶解样品并过滤，使用720N紫外可见分光光度计在波长375 nm处测量样品的吸光度,实验重复3次。
2.7 单因素实验
考察不同压力、循环次数和槲皮素浓度对槲皮素粒径的影响。初步设定压力分别为800，1000，1200，1400 bar，其他条件为循环次数20次和槲皮素浓度2%；
设定循环次数分别为10，15，20，25次，其他条件为压力1200 bar和槲皮素浓度2%；
设定槲皮素浓度分别为1%、2%、3%、4%，其他条件为压力1200 bar和循环次数20次，每组实验重复3次。
2.8 响应面设计
响应面通常可以用来评价各因素对响应值的影响，在工艺的优化方面可以减少实验次数和预测实验结果[12-13]。根据文献[14-15]，在单因素实验的基础上，选择压力(1000，1200，1400 bar)、循环次数(15，20，25次)和浓度(1%、2%、3%)，采用Design Expert 8.0软件的中心组合实验设计，以粒径的大小为响应值。响应面设计因素与水平见表1。
表1 压力、均质化循环次数和槲皮素浓度的响应面设计Table 1 Response surface design of pressure, homogenization cycle times and quercetin concentration
3.1 槲皮素样品的固态表征
槲皮素原料的PXRD衍射图见图1中a，在2θ值为10.92，12.58，24.42，27.5时可以观察到有明显的衍射峰，表明其具有良好的结晶度。但是在槲皮素固体分散体的PXRD衍射图上未检测到明显的特征峰，表明槲皮素晶体变为无定形状态。由图1中b可知，槲皮素原料在316.5 ℃时显示吸热熔融峰，而槲皮素固体分散体没有观测到显著的吸热熔融峰，这进一步验证了上述的结论，固体分散体中槲皮素的晶型变为非晶态。
图1 槲皮素和槲皮素固体分散体的粉末X射线衍射图(PXRD)和差示扫描量热图(DSC)Fig.1 Powder X-ray diffraction (PXRD) and differential scanning calorimetry (DSC) of quercetin and quercetin solid dispersion
3.2 单因素实验结果
由图2中a可知，当压力在800～1200 bar时，粒径随着压力的增大而减小，随后粒径反而增大。循环次数对粒径的影响与压力相似，见图2中b。随着循环次数的增加，粒径在循环20次时达到最小，之后粒径随着循环次数的增加而增大。由图2中c可知，过高的槲皮素浓度会导致原料的最终粒径过大，浓度在2%左右得到的粒径较小。
图2 压力(a)、循环次数(b)和槲皮素浓度(c)对槲皮素粒径的影响Fig.2 Effects of pressure (a), cycle times (b) and quercetin concentration (c) on quercetin particle size
3.3 响应面设计结果及分析
根据表1的影响因素，利用Design Expert软件设计的15组实验设计组合和实验测得的粒径大小见表2。
表2 响应面实验设计结果Table 2 Response surface experimental design results
对表2中实验数据进行二次多项式回归拟合，得到模型的回归线性方程为Y=246.33-105.00A-42.88B+68.38C+15.00AB-17.50AC+39.25BC+129.71A2+93.96B2+148.96C2。
根据实验设计结果进行数据处理，获得响应面二次模型的方差分析，见表3。
表3 响应面二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface quadratic model
由表3可知，模型的F值为47.91和P值<0.05，说明模型具有较高的显著性，回归线性方程具有良好的拟合性，可对实验结果进行预测。此外，压力、循环次数和槲皮素浓度的P值均小于0.05，证明它们对粒径都有着较大的影响。实验因素的F值越大，表明该因素对响应值的影响越显著[16]。压力的F值为125.54，循环次数的F值为20.93，槲皮素浓度的F值为53.23，即各因素对粒径的影响力强弱顺序为压力>槲皮素浓度>循环次数。
3.4 响应面图分析
根据实验数据绘制出的响应面图见图3～图5，通过响应面坡度的陡峭程度来衡量各实验因素对粒径的影响强弱,坡度越陡峭表明影响力越大[17]。
图3 压力和循环次数对粒径的影响Fig.3 Effect of pressure and cycle times on particle size
图4 压力和槲皮素浓度对粒径的影响Fig.4 Effect of pressure and quercetin concentration on particle size
图5 循环次数和槲皮素浓度对粒径的影响Fig.5 Effect of cycle times and quercetin concentration on particle size
由图3和图4可知，压力的坡度比循环次数和槲皮素浓度更为陡峭，表明其对粒径的影响较大。由图5可知，循环次数和槲皮素浓度的坡面呈现凹形，表明它们对粒径的影响不是线性关系。槲皮素浓度的坡度相对于循环次数较为陡峭，说明槲皮素浓度对粒径的影响比循环次数明显。
以粒径最小为工艺的最终优化目标，获得的实验因素组合(组合较多，仅列出部分)见表4。
表4 响应面优化设计和结果Table 4 Design and results of response surface optimization
为了考察工艺参数的准确性，选取多组数据进行实验。当压力为1306.67 bar、循环次数为21次和槲皮素浓度为2.00%时，实验测得的粒径为224 nm；
当压力为1320.00 bar、循环次数为23次和槲皮素浓度为1.60%时，实验测得的粒径为235 nm。试验值和理论值相对误差极小，证明采用响应面法优化的工艺参数具有可行性。根据上述组合设计出的最优工艺参数为：高压均质机的压力1300.00 bar、循环次数20次和槲皮素浓度2.00%。
3.5 体外的溶出度
在纯水作为溶出介质的溶出实验中，槲皮素原料在60 min时仅溶出8.2%。槲皮素固体分散体与原料相比显示出更快、更高的溶解行为，其仅在5 min时就可释放33%，远高于槲皮素原料在60 min时的溶出度，原因是非晶态和PVP(润湿性和分散性)的共同作用。槲皮素纳米粒在3 min时就可溶出6.5%和60 min时达32.5%(大约是原料的4倍)，与槲皮素原料相比溶出度得到显著的提升。这是由于减小粒径可以增大颗粒与溶出介质的接触面积，加快释放速率和提高溶出度[18]。槲皮素固体分散体与槲皮素原料纳米粒相比，表现出更高的溶出度和溶出速率,这说明槲皮素晶型的改变(即非晶态)对溶出度的影响比仅减小原料的粒径更为显著。在非晶态的基础上减小粒径，可以进一步提高溶出速率和溶出度。在颗粒尺寸的减小和非晶态双重作用下，非晶态槲皮素纳米粒在3 min就可溶出49.1%，10 min就可达到最大溶出度88.2%，表现出最快的溶出速率和最高的溶出度(大约是原料的11倍)。
图6 槲皮素原料、槲皮素固体分散体以及它们的纳米粒溶出曲线Fig.6 Dissolution curves of quercetin raw material, quercetin solid dispersion and their nanoparticles
由图6可知，制备的槲皮素纳米粒的溶出度得到极大的提高，预测在相同的抗氧化效果下，所需的用量比原料用量大大减小，对于调味等效果可带来改变。
通过将八角中提取的槲皮素与PVP-K30旋转蒸发法制备得到的固体分散体进行纳米化，制备得到的槲皮素固体分散体纳米粒在纯水中的溶出度与槲皮素原料相比显示出极大的提高，这充分证实了两步法(固体分散体结合高压均质技术)在提高槲皮素溶出度方面的优势。溶出度的提升预计可以提高其抗氧化能力，如果作为抗氧化剂用于食品中，可以延长食品的保存时间。采用响应面法对槲皮素固体分散体纳米粒的制备工艺进行优化，为了便于实验研究，确立最优的工艺参数组合为高压均质机的压力1300 bar、循环次数20次和槲皮素浓度2%，此时获得的粒径大小范围在220～235 nm之间。
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