鸡UCP3基因结构与功能的生物信息学分析
时间：2023-05-29 18:20:14 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
徐支青, 邱桂如,2, 税 斐, 江洪峰, 谢艳霞, 程智中,*
(1.安徽农业大学, 安徽 合肥 230036; 2.安徽医科大学, 安徽 合肥 230032;3.安徽省畜禽遗传资源保护中心, 安徽 合肥 231283)
解偶联蛋白(Uncoupling proteins,UCPs)是存在于线粒体内膜上的一种转运蛋白,具有转运质子的功能[1-2],可降低呼吸链氧化磷酸化过程中二磷酸腺苷(ADP)转化为三磷酸腺苷(ATP)的效率,使ATP氧化产生的多余能量以热能的形式释放,借此帮助动物在低温环境下维持体温,但在同样采食量下,产热更多的家禽能量损耗更多,饲料利用率也更低,所以UCPS是影响家禽生长和饲料效率性状的重要因子,同时，其还参与机体的能量代谢、脂肪沉积和活性氧(ROS)调节等过程[3-4]。
UCP3作为UCPS家族的重要一员,近年来一直备受关注。研究发现UCP3介导脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO),进而激活UCP1[5],两者共同作用后作为质子载体经质子漏作用释放热量,降低ATP合成。此外,前期研究表明,UCP3可阻止脂肪酸氧化和脂肪沉积,其通过减少活性氧含量防止细胞氧化损伤和维持生物体内能量代谢平衡,进而控制机体基础代谢率[4]。UCP3作为能量代谢过程中重要的调控蛋白,主要在骨骼肌和深色脂肪中表达,对机体脂质代谢、脂肪酸氧化和脂肪沉积起重要作用,并对许多物种的生长和饲料效率具有重要的调控作用。
张继等[6]对猪UCP3基因研究发现,其与肉质性能相关的SNPs位点有6个,且该基因表达量与肌内脂肪沉积和肉品质呈正相关。早期研究发现,UCP3基因在安格斯牛的皮下脂组织中表达量最高[7],在抗寒猪品种中的表达量亦显著增加,揭示UCP3基因是机体产热的重要调控因子,对脂质代谢和脂肪合成具有潜在影响。Jin等[8]研究发现,UCP3rs13997809、rs13997811和rs13997812这3个SNP点位与肉鸡的生长发育相关,可将UCP3基因多态位点应用于肉鸡分子育种研究。
生物信息学是基于计算机学科和生物学科的一个新兴交叉学科[9-10],为深入研究基因和蛋白功能等提供理论支持和研究方向[11-12]。本研究借助现代生物信息分析软件研究鸡UCP3基因序列及其编码蛋白质的结构和特征,为研究该基因在鸡能量平衡和脂类代谢的调控作用提供参考。
1.1 目的基因与氨基酸序列获取
通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)获得鸡UCP3基因氨基酸序列(NP_989438.1)和核酸序列(NM_204107.1),以及火鸡(Meleagris gallopavo,NP_001290093.1),鹌鹑(Coturnix japonica,BAK26782.1),黑天鹅(Cygnus atratus,XP_035426287.1),绿头鸭(Anas platyrhynchos,XP_005025582.2),猪(Sus scrofa,NP_999214.1),山羊(Capra hircus,XP_005690021.3),牛(Bos taurus,AAC61762.1),黑猩猩(Pan troglodytes,XP_001174875.2),人(Homo sapiens,AAC51367.1),小鼠(Mus musculus,AAB87084.1),大鼠(Rattus norvegicus,AAB71523.1),非洲爪蟾(Xenopus laevis,XP_018094292.1),斑马鱼(Danio rerio,NP_955817.1)等14种物种的氨基酸序列,根据以上遗传信息对鸡UCP3基因的生物信息学进行分析。
1.2 鸡UCP3基因生物信息学分析
利用表1中生物信息学软件对UCP3基因编码的氨基酸序列进行分析,比对不同物种的UCP3基因氨基酸序列的同源性和构建系统进化树。比对采用NCBI中的Blastp工具,系统发生树采用MEGA 7.0进行构建。
表1 序列在线分析软件和网站Table 1 Online sequence analysis software and website
2.1 鸡UCP3蛋白理化性质与亲疏水性分析
理化性质分析显示百分比较高的为Ala (A) 10.1%、Leu (L) 11.1%、Val (V) 10.1%,百分比较低的是His (H) 0.3% 和Trp (W) 0.7%;带正电荷的氨基酸残基(Arg和Lys)较多(表2),且理论等电点为9.50,说明该蛋白为碱性蛋白质;不稳定系数为41.02,高于40,表明该蛋白为不稳定蛋白;UCP3基因编码的蛋白分子式为C1 478H2 384N410O422S15,原子总数为4 709,脂肪指数为97.82,相对分子质量为33 130.58,说明该蛋白是一个强脂溶性蛋白。
表2 UCP3蛋白中氨基酸组成Table 2 Amino acid composition of UCP3 protein
蛋白亲疏水性预测在第258位出现最大值为2.367,第155位出现最小值为-2.322,且氨基酸序列绝大部分为疏水性残基(图1),预测鸡UCP3蛋白为疏水性蛋白。结合蛋白理化性质与亲/疏水性的分析,发现该蛋白是强脂溶性疏水的不稳定蛋白。
图1 鸡UCP3蛋白亲水/疏水性分析Fig.1 Hydrophilic/hydrophobicity analysis of chicken UCP3 protein
2.2 鸡UCP3蛋白磷酸化位点与糖酸化位点分析
潜在磷酸化位点预测表明，该蛋白含有25个潜在的磷酸化位点,包含12个丝氨酸(Ser)磷酸化位点、10个苏氨酸(Thr)磷酸化位点和3个酪氨酸(Tyr)磷酸化位点(图2A)。
糖基化位点预测发现(图2B),鸡UCP3蛋白无N型糖基化位点,在第52位和53位处存在潜在的O型糖基化位点。
图2 UCP3蛋白磷酸化位点与糖基化位点分析Fig.2 Analysis of phosphorylation sites and glycosylation sites of UCP3 protein
2.3 鸡UCP3蛋白二级结构和三级结构预测
鸡UCP3蛋白二级结构预测结果表明,α-螺旋比例为47.23%,β转角比例为6.84%，无规则卷曲比例为30.94%,延伸链比例为14.98%,β转角比例为6.84%(图3A)。以通用的HHbits方法对UCP3蛋白三级结构进行同源构建(图3B)，表明GMQE为0.64,QMEAN为0.48,与模板序列同源性大于30%,UCP3说明三级结构模型预测合理。
图3 UCP3蛋白二级、三级结构分析Fig.3 Analysis of the secondary and tertiary structure of UCP3 protein
2.4 结构域预测
根据Smart在线工具分析,鸡UCP3蛋白具有3个线粒体载体(Mito_carr)结构域,分别位于第 10～110位、第12～209位和第202～303位(图4)。
图4 鸡UCP3蛋白结构域预测Fig.4 Chicken UCP3 protein domain prediction
2.5 信号肽预测与亚细胞定位
鸡UCP3蛋白信号肽分析表明,max. C、max. Y和max. S值均小于0.5,且D-cutoff值为0.450。因此，推测该蛋白不具有信号肽剪切位点;S平均值(mean S)为0.165(<0.5),说明鸡UCP3蛋白不存在信号肽序列,推测该蛋白为非分泌型蛋白(图5A)。同时,TMHMM在线预测结果表明UCP3蛋白无跨膜区域(图5B),说明UCP3蛋白为非分泌型蛋白。
图5 鸡UCP3蛋白信号肽预测和亚细胞定位预测Fig.5 Prediction of signal peptide and subcellular localization of chicken UCP3 protein
经PSORT Ⅱ prediction进行亚细胞定位,推测鸡UCP3蛋白主要定位于细胞核、线粒体和细胞质中(表3),再结合Euk-mPLoc 2.0软件进行预测分析,结果显示该蛋白位于线粒体中。
表3 鸡UCP3蛋白亚细胞定位Table 3 Subcellular localization of chicken UCP3 protein
2.6 鸡UCP3基因序列及其与其他物种的同源性分析
采用NCBI的BlastP程序对14种动物的全长UCP3氨基酸序列进行对比分析(表4),表明与其他家禽UCP3氨基酸序列的相似度高达92%,其中与火鸡的同源性最高,达99.02%;与哺乳类UCP3氨基酸的相似度为71%～74%,与斑马鱼和非洲爪蟾的同源性分别为66.12%和68.65%。
表4 不同物种UCP3蛋白登录号及与鸡UCP3蛋白相似度Table 4 Similarity and accession number between UCP3 protein of different species and chicken UCP3 protein
系统进化树构建结果显示(图6)，鸡、火鸡、鹌鹑、黑天鹅和绿头鸭这些禽类形成相对独立的一支,与火鸡亲缘关系最近，说明鸟类在进化水平上更加接近；
山羊、猪、牛、人、黑猩猩、大鼠和小鼠这些哺乳类为另外一支,表明这些哺乳动物之间的遗传关系更为接近,而非洲爪蟾和斑马鱼又另成一支,该结果与同源性分析结果一致,说明UCP3基因能很好地反映物种间的遗传距离,在禽类动物中相对保守。
图6 14个物种UCP3氨基酸序列构建的NJ树Fig.6 NJ tree constructed with 14 species UCP3 amino acid sequences
UCP3基因作为机体线粒体内膜重要的转运蛋白,是影响生长性状的一种重要因子,在动物分子遗传育种领域一直备受瞩目。线粒体作为细胞代谢中心,通过电子传递链将底物氧化过程中释放的能量耦合到ATP中[13-14]。解偶联蛋白可将线粒体的底物氧化与呼吸链ATP合成过程解偶联以提高产热[15],从而降低机体代谢效率和饲料利用率[16-17]。研究发现,UCP3基因一方面可将部分原用于制造ATP的能量转化为热量[18],是影响能量代谢和脂肪沉积的重要基因，另一方面还可通过负反馈调节对底物氧化过程中产生的潜在毒性的活性氧进行调控[19-21]。因此,UCP3基因对机体的脂质代谢、脂肪沉积和氧化应激等具有重要影响，是影响能量代谢和脂肪沉积的重要基因。
大量研究表明,不同品种鸡UCP3均高表达于骨骼肌中,在心脏、肝脏、腹脂和皮下脂肪中少量表达,且其表达量高低与日龄、禁食、营养水平和饲养方式等有关[4]。前期研究发现,UCP3表达量的高低与鸡胸肌的肌内脂肪含量呈显著正相关[4],且该基因多态性与鸡体重、胴体重等生长性状显著相关[9]。
氨基酸序列中蕴含了许多蛋白质的生物信息[22-23],是蛋白生物学功能预测和基因功能研究的重要基础[24-25]。基于鸡UCP3基因氨基酸序列预测共发现25个磷酸化位点,其在氧化磷酸化过程中可能结合磷酸形成高能键,推测UCP3为不稳定蛋白。通过ProtParam在线预测鸡UCP3氨基酸理化性质,发现不稳定系数为41.02(大于40),属于不稳定蛋白,与磷酸化预测结果一致。UCP3蛋白疏水性为不稳定的疏水性蛋白,进一步佐证UCP3属于不稳定蛋白。Rupprecht等[26]、Pecqueur等[27]和Rousset等[28]发现UCP3蛋白在翻译调节中寿命很短,本研究结果与其一致。前人研究表明,UCP3基因主要表达于骨骼肌、心肌和棕色脂肪(BAT)中,这三种组织均依赖脂肪酸的氧化功能,而脂肪酸的氧化又与线粒体活性氧产生率有关。基于信号肽和亚细胞定位结果,推测该蛋白分子不具有信号肽功能,属于非分泌型蛋白,且预测其在线粒体中,具有3个线粒体载体(Mito_carr)结构域,符合其在线粒体中发挥功能的特性,这与前人的研究一致。
通过鸡UCP3氨基酸序列和其他13种物种对比表明,UCP3基因在禽类中保守程度很高,同源性在92%以上,与其他物种同源性在70%左右,但与两栖类和鱼类的同源性相对较低,说明UCP3基因在生物演化过程中较为保守,随着时间推进,累积的基因变异增多,基因编码的蛋白也出现相应变化,在系统进化树上也表现为不同的分支。
综上所述,UCP3基因编码的蛋白为不稳定的疏水蛋白,具有3个线粒体载体结构域和多个磷酸化位点,其定位于线粒体,并与火鸡遗传距离近,该研究结果可为进一步深入探究鸡UCP3基因的分子生物学功能提供重要参考。
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