同型半胱氨酸通过促进细胞焦亡和上调琥珀酸脱氢酶亚基A诱导神经炎症反应
时间：2022-12-05 21:55:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
唐小卿， 张盼盼， 魏海军
(1.南华大学衡阳医学院神经科学研究所，湖南省衡阳市 421001；
2.湖南环境生物职业技术学院生理教研室，湖南省衡阳市 421005)
同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)是蛋氨酸代谢为半胱氨酸过程中形成的一种含硫氨基酸。在神经退行性疾病阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)[1]和帕金森(Parkinson’s disease,PD)[2]患者血清中均检测到高水平Hcy。研究表明Hcy可诱导神经细胞发生神经退行性病变[3]，但其机制尚未完全阐明。高水平Hcy可导致神经炎症产生[4]，而神经炎症是诱发神经退行性疾病的重要危险因素。细胞焦亡作为一种促炎性程序性细胞死亡方式，能够促进神经炎症的发生[5]。琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)是一种线粒体复合酶，参与了琥珀酸氧化为延胡索酸和线粒体电子传递链中电子传递等过程。有研究显示，SDH活性升高后可增强琥珀酸氧化并促进炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达[6]。琥珀酸脱氢酶亚基A(SDH subunit A,SDHA)是SDH催化琥珀酸代谢反应的主要活性亚基，其表达水平升高可促进炎症因子的产生[7]。本文在小鼠海马神经元HT22细胞上，观察Hcy对细胞焦亡、SDHA蛋白表达及神经炎症反应的影响，以明确Hcy引起的神经炎症反应与其促进细胞焦亡、上调SDHA表达是否有关，为阐明Hcy诱导神经退行性疾病的机制提供新认识。
1.1 细胞株及主要试剂
HT22细胞(舜冉生物科技有限公司提供)；
DMEM培养基、Hcy(美国Sigma公司)；
胎牛血清(Excell公司)；
胰蛋白酶消化液(Trypsin-EDTA)(美国Gibco公司)；
青霉素-链霉素溶液(广州赛国生物科技有限公司)；
GAPDH抗体、FITC标记羊抗兔IgG(美国Proteintech公司)；
细胞核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3(NLRP3)抗体、Caspase-1抗体、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体、IL-18试剂盒(美国Abcam公司)；
焦亡相关蛋白消皮素(GSDMD)抗体(美国Affinity Biosciences公司)；
SDHA(SDHA)抗体(CST赛信通公司)；
IL-1β试剂盒(美国R&D Systems公司)；
Dil(DilC18(3))细胞膜橙红色荧光探针(翌圣生物科技股份有限公司)；
CCK-8试剂盒(日本Dojindo公司)。
1.2 细胞培养及分组
HT22细胞采用DMEM、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每隔2天进行一次传代培养。分别设置对照组(Hcy,0 mmol/L)、低Hcy组(Hcy,1.25 mmol/L)、中Hcy组(Hcy,2.50 mmol/L)和高Hcy组(Hcy,5.00 mmol/L)，根据分组给与不同浓度Hcy作用细胞24 h。
1.3 CCK-8检测细胞活性
取对数生长期细胞接种于96孔板培养，每个组设置6个复孔，加入不同浓度Hcy(0、1.25、2.50、5.00 mmol/L)DMEM培养基培养24 h，培养结束后弃去上清，将DMEM培养基与CCK-8溶液按照10∶1比例配置，每个实验孔加入100 μL并设置6个空白对照孔，放置在培养箱中反应1.5 h后在酶标仪波长450 nm处测定光密度值(OD)。细胞存活率(%)=(实验孔OD值-空白孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)×100%。
1.4 免疫荧光法检测细胞形态及GSDMD膜表达水平
根据不同实验分组将细胞接种于细胞爬片，首先使用Dil(DilC18(3))细胞膜橙红色荧光探针染液孵育细胞20 min，吸干染液后,用培养基清洗爬片2～3次，每次用预温的培养基覆盖所有细胞，孵育5～10 min，吸干培养基；
随后用多聚甲醛固定细胞30 min，PBS冲洗3次后用含0.1% Triton100和10%血清的PBS避光封闭1 h，不清洗直接加入配置好的GSDMD(1∶200)抗体于4 ℃避光孵育过夜，孵育结束后PBS冲洗3次；
加入FITC标记羊抗兔IgG(Green,1∶100)室温避光孵育1 h，PBS冲洗3次；
用DAPI避光染色10 min，PBS冲洗3次后将细胞爬片转移至载玻片上,甘油(甘油∶PBS=3∶2)封片，用荧光显微镜观察。
1.5 Western blotting检测蛋白表达
细胞传代后接种在培养皿中，根据不同分组培养HT22细胞后，弃去上清，用预冷PBS清洗细胞2次，将培养皿中的PBS完全吸干后，每个皿里加入150 μL RIPA细胞裂解液，用细胞刮刀将细胞从培养皿中刮下，放置在冰上裂解30 min后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，BCA法测定蛋白水平。10%SDS-PAGE分离胶电泳，250 mA 60 min湿转后转至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭2 h后加入对应目的蛋白一抗(1∶1 000)4 ℃条件下孵育过夜；
回收一抗后TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，加入相应的二抗(1∶5 000)孵育2 h，再次用TBST洗涤PVDF膜2次，每次10 min；
最后用ECL显色液显色，Image J软件分析蛋白条带灰度值。
1.6 ELISA检测炎症因子
根据不同分组培养HT22细胞，根据酶联免疫吸附试剂盒说明书操作测定IL-1β和IL-18水平，反应结束后在酶标仪450 nm波长处测定OD值后计算IL-1β和IL-18水平。
1.7 统计分析
2.1 Hcy对HT22细胞活力的影响
与对照组比较，1.25、2.50、5.00 mmol/L Hcy处理的HT22细胞活力显著降低，并呈剂量依赖性(P<0.05；
表1)，表明Hcy可引起神经细胞退行性病变。
2.2 Hcy对HT22细胞炎症因子的影响
炎症因子IL-1β和IL-18的水平在2.50、5.00 mmol/L Hcy处理后显著升高，且高、中Hcy组高于低剂量组(P<0.05；
表1)，表明Hcy可诱导HT22细胞产生神经炎症反应。
表1 Hcy对HT22细胞活力和炎症因子IL-1β、IL-18水平的影响(n=5)
2.3 Hcy对HT22细胞形态和焦亡相关蛋白GSDMD与细胞膜共定位情况的影响
经1.25、2.50、5.00 mmol/L Hcy处理后发现，HT22细胞突触受到损伤，GSDMD与细胞膜共定位增强(显示为黄色荧光增强)，且随着Hcy浓度升高，细胞膜发生破裂(图1)。以上结果表明，Hcy处理后导致GSDMD在细胞膜上积累，并进一步导致细胞膜破裂，提示Hcy可诱导HT22细胞发生焦亡。
图1 Hcy对HT22细胞形态和焦亡相关蛋白GSDMD与细胞膜共定位情况的影响(免疫荧光法，900×)绿色荧光标记GSDMD，橙红色荧光探针标记细胞膜，蓝色荧光标记细胞核，黄色荧光强度表示GSDMD与细胞膜的共定位水平。
2.4 Hcy对HT22细胞焦亡相关蛋白表达的影响
与对照组比较，2.50、5.00 mmol/L Hcy可显著上调HT22细胞NLRP3(图2A)、ASC(图2B)、cleaved-Caspase-1和pro-Caspase-1(图2C)及GSDMD-N和GSDMD(图2D)等蛋白的表达水平，且高Hcy组高于低Hcy组(P<0.05)，表明Hcy可诱导HT22细胞焦亡。
图2 Hcy对HT22细胞焦亡相关蛋白NLRP3(A)、ASC(B)、pro-Caspase-1和cleaved-Caspase-1(C)、GSDMD和GSDMD-N(D)表达水平的影响1为对照组；
2为低Hcy组；
3为中Hcy组；
4为高Hcy组。a为P<0.05，与对照组比较；
b为P<0.05，与低Hcy组比较。
2.5 Hcy对HT22细胞SDHA蛋白表达的影响
1.25、2.50、5.00 mmol/L Hcy显著上调HT22细胞SDHA蛋白的表达水平(P<0.05,图3)，表明Hcy诱导的神经炎症反应与其上调SDHA的表达有关。
图3 Hcy对HT22细胞SDHA蛋白表达的影响1为对照组；
2为低Hcy组；
3为中Hcy组；
4为高Hcy组。a为P<0.05，与对照组比较。
Hcy已经被证明是神经退行性疾病的高危险因素。有研究发现Hcy可通过诱导脑内Aβ沉积促进AD发生发展[8]。高水平Hcy不仅可诱导小鼠脑内tau蛋白磷酸化，还可导致记忆功能损伤[9]。因此，深入阐明Hcy诱导神经退行性病变的机制，可为神经退行性疾病防治提供新靶点和新思路。本研究实验发现Hcy处理后，HT22细胞活力显著降低，表明Hcy对神经细胞具有毒性作用。HT22细胞是小鼠海马神经元细胞系，是目前研究神经退行性疾病的常用细胞系，因此，本研究结果验证了Hcy的促神经退行性病变作用。为此，本文将深入探讨Hcy促进HT22细胞损伤的机制，以阐明Hcy诱导神经退行性病变的机制。
有研究表明，高水平Hcy可导致炎症的产生[10]。基于神经炎症在神经退行性病变中具有重要地位[11]，本研究首先观察Hcy是否可使HT22细胞产生神经炎症反应。本研究结果显示，Hcy处理HT22细胞后，炎症因子IL-1β和IL-18水平显著升高，表明Hcy可使HT22细胞产生神经炎症反应。因此，深入探讨Hcy诱导HT22细胞产生神经炎症反应的机制，将有助于更好地理解Hcy诱导神经退行性病变的机制。
细胞焦亡是一种由炎症小体介导且依赖于Caspase-1激活的促炎性程序性细胞死亡方式。Caspase-1前体与NLRP3通过接头蛋白ASC形成炎症小体，前体Caspase-1被激活后通过切割GSDMD形成GSDMD-N端游离肽段，游离肽段形成PFD聚集在细胞膜上形成大的孔道，导致细胞肿胀和膜破裂；
同时，Caspase-1激活还进一步切割pro-IL-1β与pro-IL-18形成成熟的IL-1β和IL-18引发炎症反应[12-13]。本研究结果显示，在Hcy处理的HT22细胞中，HT22细胞突触受到损伤，且GSDMD在细胞膜上的表达水平显著升高，细胞膜完整性丢失，焦亡相关蛋白NLRP3、ASC、pro-Caspase-1、cleaved-Caspase-1、GSDMD和GSDMD-N的表达均显著上调，炎症因子IL-1β和IL-18水平升高，表明Hcy可诱导HT22细胞焦亡，并引发炎症反应。这些结果拓展了对Hcy和细胞焦亡、Hcy和神经炎症之间关系的理解，即Hcy可通过诱导神经细胞焦亡而引发神经炎症反应。NLRP3炎症小体介导的焦亡在AD中具有重要作用，通过抑制NLRP3/Caspase-1信号通路可以改善AD小鼠的认知功能障碍[14]。通过抑制GSDMD剪切和炎症因子IL-1β与IL-18的生成能有效改善PD的运动障碍[15]。这些研究证明，通过抑制神经细胞焦亡继而减轻神经炎症可改善神经退行性疾病。基于Hcy在神经退行性疾病发病中的重要作用，抑制Hcy诱导的细胞焦亡极有可能通过减轻神经炎症反应改善神经退行性疾病。
SDHA是复合物酶SDH活性的关键结构亚基[16]。SDHA表达水平升高能够促发细胞内炎症基因转录[7]。有研究证明，抑制SDH的活性可以有效降低神经炎症的发生[17]。本研究结果显示，Hcy处理可显著升高HT22细胞SDHA蛋白的表达水平，表明SDHA上调与Hcy促进神经炎症的发生密切相关。有研究报道，SDHA可诱导ROS生成增强细胞的氧化应激水平[18]。实际上，ROS水平升高能够通过激活炎症小体NLRP3进一步诱导细胞发生焦亡[19]。结合本研究结果推测，Hcy上调SDHA表达后可通过升高ROS水平而诱导神经细胞发生焦亡。
综上所述，本研究认为Hcy导致的神经毒性与其诱导神经细胞发生焦亡、上调SDHA表达密切相关。基于神经细胞焦亡对神经炎症和神经退行性疾病的调节作用，本研究提示，抑制神经细胞焦亡可能是治疗Hcy诱导的神经炎症和改善神经退行性疾病的有效作用途径。本研究还提示SDHA可能是直接导致Hcy诱导神经细胞焦亡和神经炎症的重要机制。因此，抑制SDHA也有望成为防治Hcy诱导神经细胞焦亡引发神经炎症和神经退行性疾病的新方法。本研究为防治Hcy诱导的神经退行性疾病提供了新思路。
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