[叶酸脂质体包裹的MYCN,siRNA在裸鼠体内靶向治疗作用的初步研究] 脂质体包裹技术
时间：2019-05-04 03:21:15 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
[摘要] 目的 研究叶酸受体为靶向的脂质体包裹MYCN基因小干扰性RNA在神经母细胞瘤裸鼠骨髓、骨转移模型中的靶向性及治疗作用。 方法 16只成功建立神经母细胞瘤骨髓、骨转移模型的裸鼠，将其随机分为靶向性研究组（4只）和疗效性研究组（12只）。靶向性研究组裸鼠静脉给予CY3荧光标记叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA，荧光显微镜检测CY3在体内瘤组织及重要器官的荧光强度。疗效性研究组12只裸鼠随机分MYCN siRNA组和无关siRNA组，静脉分别给予叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA与叶酸脂质体包裹的无关siRNA，采用荧光定量PCR检测肿瘤组织MYCN mRNA表达，原位细胞凋亡检测法（TUNEL）观察肿瘤细胞凋亡数。 结果 CY3荧光标记的叶酸脂质体MYCN siRNA给药8 h后，荧光主要分布在肿瘤组织内，MYCN siRNA组瘤组织中MYCN mRNA的表达量明显较无关siRNA组降低（P ＜ 0.05），MYCN siRNA组凋亡细胞数量高于无关siRNA组（P ＜ 0.05）。 结论 ①叶酸脂质体MYCN siRNA经静脉给药后主要靶向瘤组织，叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体；②叶酸脂质体MYCN siRNA在体内显著下调肿瘤MYCN mRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡，有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。
[关键词] 神经母细胞瘤；MYCN；叶酸受体；脂质体；动物模型
[中图分类号] R737.9 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）06（a）-0022-03
神经母细胞瘤是儿童最常见的颅外实体瘤，占儿童肿瘤的7%～10%。多数患儿就诊时肿瘤已转移，转移部位以淋巴结、骨髓及骨多见，在强烈化疗、自体造血干细胞移植及诱导治疗后，其预后仍然很差。目前广泛应用的化疗由于其缺乏特异性，对正常组织细胞毒副作用大，需要探索新的靶向治疗方法。20%～25%神经母细胞瘤患儿有MYCN原癌基因扩增，大量研究显示，MYCN扩增提示疾病预后不良。因此，MYCN是治疗神经母细胞瘤的特异性分子靶点之一。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是近年发展起来的研究基因功能的实验技术，RNAi或基因沉默由小分子干扰核糖核酸（small interfering RNAs，siRNAs）介导，降解与其同源的mRNA。给予针对肿瘤细胞内的癌基因或促癌基因的siRNA药物以介导肿瘤细胞基因沉默，已成为肿瘤分子靶向治疗的热点。部分siRNA药物已进入Ⅰ期临床试验，但仅限于肿瘤局部给药，如肿瘤内注射、眼内给药等。因siRNA全身给药有血流稳定性差和体内分布差的缺点，静脉应用仍停留在动物实验研究阶段。
为了把siRNA定向地输送到肿瘤细胞，笔者选择脂质体作为载体，用纳米脂质体包裹siRNA，提高药物在体内的稳定性及靶向性，同时在其表面耦联叶酸分子，通过叶酸分子与肿瘤细胞表面叶酸受体特异性结合，实现主动靶向治疗。在体外实验中，笔者体外化学合成并筛选出针对MYCN基因的siRNA，应用叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA作用于神经母细胞瘤LA-N-5细胞，MYCN基因mRNA表达水平显著下降[1]。本实验仍以MYCN基因为靶点，研究叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA在裸鼠体内的靶向治疗作用。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
LA-N-5细胞用含15%胎牛血清的RPMI 1640培养，置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。造模当天用0.1％胰蛋白酶和0.1％EDTA的混合溶液进行消化，无血清培养液调节细胞浓度至1×107/mL。
1.2 叶酸脂质体siRNA制备
叶酸脂质体MYCN siRNA及CY3标记的叶酸脂质体MYCN siRNA均由美国俄亥俄州大学药学院Robert J Lee教授合成惠赠。MYCN siRNA序列为：正义链：5’-CGG AGA UGC UGC UUG AGA Adtdt-3’；反义链：5’-UUC UCA AGC AGC AUC UCC Gdtdt-3’。
1.3 实验动物分组及骨髓、骨转移模型的建立
BALB/C裸鼠16只，雌性，4周龄，重15 g左右，由解放军总医院动物实验中心提供，均在无特定病原体状态（SPF）条件下饲养于层流架内，饲料、饮水及垫料均经高压灭菌处理，清洁水和饲料供小鼠自由摄入。裸鼠匀用10 g/L戊巴比妥钠（75 mg/kg）麻醉，右股骨及膝盖皮肤用碘伏消毒。从股骨末远端皮肤做一小侧切口（8～10 mm），沿筋膜钝性分离股骨侧面肌肉，用镊子固定暴露的股骨下段。用26 G的无菌针从髌骨上、两股骨髁间钻过骨质进入骨髓腔。然后取出无菌注射针，换Humilton注射器的穿刺针，插入骨髓腔直到进入股骨近端干骺端。缓慢注射入人神经母细胞瘤LA-N-5细胞悬液5 μL，约1×105个肿瘤细胞，然后缓慢拔出针头，后用骨蜡封闭针孔缝合皮肤伤口。待裸鼠苏醒后回笼。5周末肿瘤直径径达5 mm，骨髓、骨转移模型建立成功，随机取4只用于靶向性研究实验，12只用于疗效性研究实验。
1.4 MYCN siRNA靶向性研究实验步骤
4只成瘤祼鼠，经鼠尾静脉给予CY3标记的叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA，给药剂量为3 mg/kg，8 h后处死小鼠，取出小鼠股骨瘤体、心、肺、肝、肾，冰生理盐水迅速清洗残留血液，OCT包裹，冰冻切片机切片，制成4 μm切片。荧光显微镜200倍视野下观察，每只小鼠的每个器官随机选取3个视野采集图像，并用计算平均累积光密度值（IOD）进行各器官荧光强度比较。
1.5 MYCN siRNA体内效应实验步骤
12只裸鼠随机分为两组，每组6只，分别经鼠尾静脉注射叶酸脂质体包裹的MYCN siRNA、叶酸脂质体包裹的无关siRNA，连续5 d，给药剂量为3 mg/（kg·d）。于第6天断颈法处死，取下裸鼠股骨肿瘤，-80℃保存。 1.6 MYCN基因实时定量PCR检测
用超纯RNA提取试剂盒提取组织样本中总RNA，经电泳显示28S、18S清晰两条带，用HiFi-MMLVcDNA第一链合成试剂盒进行反转录，应用实时荧光定量RT-PCR法（Roche 480Ⅱ型荧光定量PCR仪）检测瘤组织中MYCN基因mRNA表达水平，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。MYCN基因上游引物序列：5’-CTCAGTACCTCCGGAGAG-3’，下游引物序列：5’-GGCATCGTIGAGGATC-3’，内参照GAPDH基因上游引物序列：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’；下游引物序列：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。实时荧光定量RT-PCR反应体系20 μL，扩增程序为：95℃ 10 min，以95℃ 15 s，60℃ 60 s循环40次。
1.7 TUNEL法检测裸鼠肿瘤细胞凋亡
脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）介导的d-UTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediate d-UTP nick end labeling，TUNEL）检测RB细胞凋亡：行4 μm冰冻切片，丙酮固定，3％过氧化氢-甲醇溶液处理切片20 min，PBS洗涤3 min×3次。蛋白激酶K 37℃消化20 min，TBS液洗涤3 min×3次。每一标本加含TdT和地高辛标记的脱氧尿苷酸（digoxigenin labelled desoxyuridinetriphosphate，DIG-UTP）各11及18的标记缓冲液共20 μL，37℃湿盒中标记2 h，TBS洗涤3 min×3次。加封闭液50 μL，室温孵育30 min，甩掉封闭液后加生物素化的抗地高辛抗体50 μL，37℃湿盒中孵育30 min，TBS洗涤3 min×3次。加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物溶液（strept avidin-biotin-peroxidase complex，SABC）50 μL，37℃下反应60 min，TBS洗涤3 min×3次。DAB显色20 min，苏木素轻度复染。脱水，透明，封片，于显微镜下观察，每张切片随机选取5个400倍视野照相，计算每1 000个细胞中TUNEL染色阳性细胞数百分比，作为凋亡指数（AI）。
1.8 统计学方法
采用SPSS 13.0统计软件处理数据，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用χ2检验。以P 综上所述，叶酸脂质体MYCN siRNA在裸鼠体内靶向肿瘤组织，叶酸脂质体是肿瘤基因治疗的有效载体。叶酸脂质体MYCN siRNA在体内显著下调肿瘤MYCN mRNA的表达，促进肿瘤细胞凋亡，有望成为神经母细胞瘤治疗的新药物。
[参考文献]
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（收稿日期：2012-04-20 本文编辑：卫轲）
