菟丝子总黄酮中拟雌激素作用的活性成分筛选,Δ
时间：2023-06-27 22:25:01 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
岳 霞，宋 辉，徐 媛，刘迪施，孙向明 ，李文兰（哈尔滨商业大学药学院，哈尔滨 150076）
菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australisR.Br.或菟丝子Cuscuta chinensisLam.的干燥成熟种子，其用药历史悠久，为补益类常用中药[1]，具有补肾益精、安胎明目等多种功效[2]。近年来，多项研究发现菟丝子在激素调节[3]、保肝明目[4]、保护心脑血管[5]、抗癌[6]和抗衰老[7]等方面表现出一定的药理疗效。菟丝子植物分布广泛，主要分布于黑龙江、内蒙古、甘肃、山东等地，学者们从菟丝子中已提取出多类化学成分，如黄酮类、生物碱类、木质素类、有机酸类和其他成分等[8―9]。
当妇女进入更年期后，各类雌激素指标骤然下降，从而出现月经失调、烦闷易怒、入睡困难等更年期症状，雌激素替代疗法可以使更年期症状得到明显改善；
但长期使用人工合成的雌激素易对身体造成极大的损伤，如心脑血管损伤、肾脏损伤以及其他疾病等[10]。为此，科学家们不断寻求更为安全、有效的雌激素替代物。目前，国内外已有多种关于选择性雌激素受体调节剂和其他辅助药的报道，其中尤为重要的一类药物就是植物雌激素[11―12]，其被认为是一种更安全、更有前途的雌激素替代品。
本课题组前期研究表明，菟丝子醇提物有显著的拟雌激素活性，且其拟雌激素活性成分多为黄酮类[13]。本研究首先对菟丝子总黄酮的拟雌激素作用进行验证，建立10批菟丝子总黄酮的指纹图谱；
然后以小鼠子宫系数、子宫内膜厚度为指标对共有峰进行活性检识，再采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱（UPLC‑Q‑TOF‑MS）技术对菟丝子总黄酮成分进行表征，明确菟丝子总黄酮中拟雌激素作用的活性成分，以期为植物雌激素类药物的开发提供参考。
1.1 主要仪器
本研究所用主要仪器有LE2O4E/O2型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Acquity型超高效液相色谱（UPLC）仪、PGA495型质谱仪（美国Waters公司），CKX53型倒置显微镜（日本Olympus公司），YN‑02B1型生物组织包埋机（深圳市永年科技有限公司）等。
1.2 主要药品与试剂
绿原酸、山柰酚、槲皮素、异鼠李素、槲皮苷、芹菜素对照品（批号分别为 20160312、20130621、20151225、20160615、20150813、20170224，纯度≥98%）均购自中国食品药品检定研究院；
金丝桃苷对照品（纯度≥98%，批号111521‑201903）购自上海金穗生物有限公司；
戊酸雌二醇（阳性对照药，批号20191038）购自拜耳医药保健有限公司；
苏木素染液、伊红染液（批号分别为20190504、20190103）购自北京索莱宝生物科技公司。菟丝子药材（编号S1～S10）购自不同的菟丝子种植基地，经哈尔滨商业大学药学院曲中原教授鉴定为旋花科植物南方菟丝子C.australisR.Br.或菟丝子C.chinensisLam.的干燥成熟种子，其药材产地信息见表1。
表1 菟丝子药材产地信息
1.3 动物
本研究所用动物为雌性未成年ICR小鼠，体质量为（10±2） g，购自长春国家生物产业基地实验动物中心，动物生产许可证号为SCXK（吉）‑2020‑0002。本实验经哈尔滨商业大学实验动物伦理委员会批准，批准号为HSDYXY‑2020005。
2.1 样品的制备
2.1.1 阳性对照药混悬液的制备 取戊酸雌二醇适量，用蒸馏水配制质量浓度为0.01 mg/mL的混悬液，备用。
2.1.2 供试品溶液的制备 分别称取10个不同产地菟丝子药材适量，粉碎过筛，按文献[13]方法制备总黄酮浸膏（以芦丁计，总黄酮的纯度为29.84%～31.68%）。取菟丝子总黄酮浸膏1 g，用80%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，从中取1 mL溶液转移至5 mL容量瓶中，以80%甲醇定容，过0.22 μm微孔滤膜，即得供试品溶液，备用。
2.1.3 对照品溶液的制备 分别精密称取绿原酸、金丝桃苷、山柰酚、槲皮素、槲皮苷、异鼠李素、芹菜素对照品适量，以80%甲醇溶解，并定容于10 mL容量瓶中，过0.22 μm微孔滤膜，即得混合对照品溶液。
2.2 菟丝子总黄酮拟雌激素作用考察
2.2.1 分组与给药 将小鼠随机分为空白对照组、阳性对照组（戊酸雌二醇，0.075 mg/kg，剂量根据本课题组前期预实验结果设置）和不同产地（S1～S10）菟丝子总黄酮组（8 g/kg，以菟丝子生药量计，剂量根据本课题组预实验结果设置），每组10只。给药组小鼠灌胃相应药物，空白对照组灌胃等体积蒸馏水，每天早晚各给药1次，连续4 d。
2.2.2 小鼠子宫系数和子宫内膜厚度的检测 末次给药1 h后，将各组小鼠脱颈处死，剖取子宫，称定质量，并计算子宫系数（子宫系数＝子宫质量/体质量×100%）。将子宫置于10%甲醛溶液中固定1～2 d，再进行组织包埋、切片、染色、脱水、胶封，采用显微镜观察小鼠子宫特征变化，并测量子宫内膜厚度。采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，数据均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD‑t检验。检验水准α＝0.05。结果显示，与空白对照组相比，阳性对照组和S1～S10菟丝子总黄酮组小鼠子宫系数和子宫内膜厚度（S3、S7菟丝子总黄酮组除外）均显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。空白对照组子宫内膜上皮、间质、腺体无增生，肌层排列紧密，子宫内膜壁薄，无明显增厚及突出。阳性对照组和S1～S10菟丝子总黄酮组小鼠子宫内膜增厚明显，内膜上皮由低柱状形态进展为高柱状形态，内膜间质疏松。结果见图1～图3。
图1 各组小鼠子宫系数的检测结果（±s，n＝10）
图2 各组小鼠子宫内膜厚度的检测结果（±s，n＝10）
图3 各组小鼠子宫HE染色结果 （×200）
2.3 不同产地菟丝子总黄酮的指纹图谱建立
2.3.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18R RHD（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；
保护柱为ACQUITY UPLC R BEH C18；
柱温为 40 ℃；
流速为 0.3 mL/min；
进样量为2 μL；
流动相为0.1%甲酸溶液（A）‑乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，10%B→19%B；
2～5 min，19%B；
5～6 min，19%B→44%B；
6～14 min，44%B→60%B；
14～19 min，60%B→95%B；
19～20 min，95%B→100%B）。
2.3.2 质谱条件 采用电喷雾离子源，电压为3.0 kV，温度为100 ℃，去溶剂气温度为400 ℃，去溶剂气流速为800 L/h，锥孔气流速为50 L/h。采用正负离子模型进行扫描，扫描范围为m/z50→1 200，碰撞能为20～45 mV。
2.3.3 精密度试验 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，按“2.3.1”“2.3.2”项下色谱与质谱条件连续进样6次，正离子模式选取13号峰（槲皮素）作为参照峰，负离子模式选取23号峰（槲皮素）作为参照峰，记录各共有峰相对峰面积和相对保留时间。结果显示，两种模式下各共有峰相对峰面积的RSD均小于3.0%，相对保留时间的RSD均小于2.5%（n＝6），表明仪器精密度良好。
2.3.4 重复性试验 按“2.1.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”项下色谱与质谱条件进行检测，正离子模式选取13号峰作为参照峰，负离子模式选取23号峰作为参照峰，记录各共有峰相对峰面积和相对保留时间。结果显示，两种模式下各共有峰相对峰面积的RSD均小于3.0%，相对保留时间的RSD均小于2.5%（n＝6），表明方法重复性良好。
2.3.5 稳定性试验 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，于室温放置0、3、6、8、12、24 h时按“2.3.1”“2.3.2”项下色谱与质谱条件进行检测，正离子模式选取13号峰作为参照峰，负离子模式选取23号峰作为参照峰，记录各共有峰相对峰面积和相对保留时间。结果显示，两种模式下各共有峰相对峰面积的RSD均小于3.0%，相对保留时间的 RSD均小于3.0%（n＝6），表明样品稳定性良好。
2.3.6 指纹图谱的建立 取“2.1.2”项下供试品溶液适量，按“2.3.1”“2.3.2”项下色谱与质谱条件进样分析，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）》对10批不同产地菟丝子总黄酮的指纹图谱进行分析，生成正负离子模式下的对照指纹图谱（R）和叠加指纹图谱。如图4所示，正、负离子模式下分别标出28、33个共有峰。
图4 正负离子模式下不同产地菟丝子总黄酮的叠加指纹图谱及对照图谱（R）
2.4 不同产地菟丝子总黄酮的谱‑效相关性分析
2.4.1 双变量相关性分析 采用SPSS 19.0软件进行分析，将10批不同产地菟丝子总黄酮的共有峰相对峰面积进行均值化处理后，以小鼠子宫系数、子宫内膜厚度为变量，进行双变量相关性分析，并计算Pearson相关系数，其绝对值越大表明相关性越好。结果显示，在正离子模式下，有10个共有峰与菟丝子总黄酮的拟雌激素作用相关（P＜0.05），分别是7、10、12～16、18、22、26号峰。在负离子模式下，有14个共有峰与菟丝子总黄酮的拟雌激素作用有关（P＜0.05），分别是2、5、8、9、12、16、19、22～28号峰。
2.4.2 灰色关联度分析 采用DPS软件进行分析，将10批不同产地菟丝子总黄酮的共有峰相对峰面积进行均值化处理后，以此为子序列，再以小鼠子宫系数、子宫内膜厚度为母序列，可得到子序列与相应母序列的关联度，将其按从大到小的顺序排列级组成关联序，通过关联度排序结果，判断各子序列对母序列的“贡献”程度。通常认为关联度＞0.5即存在关联，关联度越大关联性越好[14―15]。本研究选择关联度大于0.6的成分作为高度相关的成分。结果显示，正离子模式下，有19个共有峰的关联性较强，分别是3、5、7～17、19、20、24～26、28号峰。负离子模式下，有21个共有峰的关联性较强，分别是2、5、7～9、11～17、19～26、31号峰。
2.4.3 综合分析 将“2.4.1”“2.4.2”项下正负离子模式下的结果取交集发现，正离子模式下的7、10、12～16、26号峰及负离子模式下2、5、8、9、12、16、19、22～26号峰所代表的成分与菟丝子总黄酮的拟雌激素作用高度相关。
2.5 菟丝子总黄酮成分的表征
由于样本S9在正、负离子模式下所呈现的化学成分均较为全面，因此取S9样品的供试品溶液和“2.1.3”项下混合对照品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”项下色谱与质谱条件进样分析，即得菟丝子总黄酮供试品溶液及混合对照品的总离子流图（图5）。采用Waters Masslynx V 4.1软件对正、负离子模式下的总离子流图进行处理，获取各共有峰的保留时间及一、二级质谱信息，根据精确的准分子离子峰的m/z初步判断化合物的相对分子质量、元素组成和分子式，并与对照品及自建数据库中各化学成分的信息进行比对，同时参考各类化合物的裂解规律[16―20]，根据碎片离子信息推测化合物。结果见表2。
图5 菟丝子总黄酮供试品溶液及混合对照品的总离子流图
表2 菟丝子总黄酮中各色谱峰的化学成分分析结果
由表2可知，菟丝子总黄酮中共有16个拟雌激素活性成分，分别为5，7，3′，4′‑四甲氧基黄酮、6‑O‑（反式）对香豆酰基‑呋喃果糖‑（2→1）‑吡喃葡萄糖苷、芦丁、山柰酚‑3，7‑双葡萄糖苷、芹菜素‑7‑O‑葡萄糖苷、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素、杜鹃黄素、异槲皮苷、山柰酚‑3‑呋喃阿拉伯糖苷、2，6‑十八碳二炔酸。
目前，可利用乳腺癌细胞增殖率、动物血清中雌激素含量、雌激素受体的蛋白和mRNA表达水平、子宫系数、子宫内膜厚等指标来评价拟雌激素作用[21―22]。结合本课题组前期预实验结果，发现采用小鼠子宫系数和子宫内膜厚度这2个指标进行评价，可更好地反映雌激素样效果。本研究结果发现，不同产地菟丝子总黄酮的拟雌激素活性均较好。进一步在正负离子模式下建立不同产地菟丝子总黄酮的指纹图谱，发现在正、负离子模式下共有28、33个共有峰。结合双变量相关性分析和灰色关联度分析发现，正离子模式下的7、10、12～16、26号峰及负离子模式下2、5、8、9、12、16、19、22～26号峰所代表的成分与菟丝子总黄酮的拟雌激素作用高度相关。经化学成分鉴定发现，这16个成分分别为5，7，3′，4′‑四甲氧基黄酮、6‑O‑（反式）对香豆酰基‑呋喃果糖‑（2→1）‑吡喃葡萄糖苷、芦丁、山柰酚‑3，7‑双葡萄糖苷、芹菜素‑7‑O‑葡萄糖苷、金丝桃苷、紫云英苷、槲皮苷、槲皮素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素、杜鹃黄素、异槲皮苷、山柰酚‑3‑呋喃阿拉伯糖苷、2，6‑十八碳二炔酸。相关研究发现，芦丁能够提高雌性青春期大鼠雌二醇、孕酮水平，促进催乳素、生长激素分泌，上调乳腺组织中雌激素受体、孕激素受体、催乳素受体和生长激素受体的表达量，促进乳腺发育[23]。也有研究表明，槲皮素在雌激素相关疾病中的作用机制呈多元化，主要包括抗氧化作用，调控雌激素代谢，调节雌激素受体及其下游信号通路等[24]。
综上所述，本研究从菟丝子总黄酮中筛选出16种拟雌激素作用的化学成分，可为植物雌激素类药物的开发提供参考。
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