表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

黄 凯，王 豪，牛晨霞，农作荣，莫勇芳，刘文波，陈 樱，欧阳康，黄伟坚，韦祖樟

(广西大学动物科学技术学院/动物传染病与分子免疫学实验室，广西南宁 530005)

A型塞内卡病毒(Senecavirus A，SVA)原名塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus,SVV)，于2015年正式更名为Senecavirus A(SVA)，并划分至小RNA病毒科的一个新属——塞内卡病毒属，到目前为止，SVA是该属的唯一成员[1]。SVA基因组为单股正链RNA，包含5’UTR、编码一个多聚蛋白的开放阅读框(ORF)和3’UTR，大小约7 200 nt[2]。SVA原型毒株没有致病性，但近年来许多研究报道提示，SVA与猪特发性水疱病和新生仔猪死亡率升高密切相关[3-5]。SVA可感染不同年龄段猪，新生仔猪感染后死亡率较高，育肥猪和母猪感染后发病率和病死率相对较低[6]。猪感染SVA后以体温升高、口鼻附近和蹄冠部形成水疱、溃疡为主，伴随着食欲下降、精神沉郁、嗜睡、肌肉无力、跛行、腹泻和神经症状等为主[7]，与其他致水疱病相关病原，如口蹄疫病毒、猪传染性水疱病病毒、水疱性口炎病毒等，所致症状在临床上无法准确区分。目前在国内外尚无商品化SVA疫苗，如何有效防控SVA成为了一个新的难题。

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus， FMDV)引起的一种急性、烈性、高度接触传染性动物疫病，在我国被归属于一类动物疫病，FMDV感染广，传播快，它可以感染70多种野生动物[8]，其中猪、牛、羊等偶蹄动物最为易感。FMDV有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3共7种血清型，且各血清型之间不存在交叉保护性[9]。血清型A、O、Asia1感染在我国发病率最高，其中又以O型流行最为广泛[10]。FMDV在翻译病毒蛋白过程中，可形成VP1、VP2、VP3、VP4共4种结构蛋白和L蛋白、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D共8种非结构蛋白，其中VP1蛋白的G-H 环(141 aa-160 aa)和 C 末端(200 aa-213 aa)存在两个线性抗原表位，是决定FMDV抗原性、刺激宿主产生免疫应答和中和性抗体的主要抗原蛋白[11]。

随着分子生物学技术的发展，有学者通过反向遗传操作系统构建RNA病毒的全长cDNA感染性克隆，在cDNA水平对病毒基因组进行操作，将外源基因插入病毒基因组，构建重组病毒进行目的蛋白表达[12]。SVA 2A蛋白的C端具有小RNA病毒科的保守基序NPG↓P[3]，研究表明，小RNA病毒科的多种病毒都可在该位置引入外源基因。Sharma B等[13]在2019年成功拯救了1株重组SVA，并对其免疫原性及安全性进行了评估，结果显示重组病毒对猪没有明显致病性，重组病毒毒力减弱，但依然具有良好的免疫原性，提示SVA可能是一种理想的活病毒载体，对于研发以SVA为载体的基因工程疫苗提供了重要参考。另外，有研究在SVA全长基因组中插入了增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)基因，并且表达出增强型绿色荧光蛋白，所拯救的含有EGFP基因的重组SVA毒株具有良好的遗传稳定性以及与亲本毒株相似的生物学特性[14-15]。

广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室(以下简称本实验室)前期以分离得到的毒株SVA CH-GX-01-2018(GenBank：MK039162.1)[16]为基础，成功构建了SVA全长感染性克隆pSVA-GX01，并在SVA 2A与2B基因之间插入了绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因，且成功表达。本研究在上述研究基础上，将绿色荧光蛋白基因替换为O型口蹄疫病毒VP1蛋白基因，以期获得表达猪O型FMDV VP1蛋白的重组SVA，并对拯救所得的重组SVA进行鉴定与体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析，为研发一种新型的基因工程活载体疫苗用于塞内卡病毒和口蹄疫病毒的免疫保护奠定基础。

1.1 材料

1.1.1 质粒和细胞 以本实验室前期分离得到的毒株SVA CH-GX-01-2018(GenBank：MK039162.1)[16]为基础，将SVA CH-GX-01-2018株全长基因组分段克隆至pBluescript载体，并在其5′端引入CMV启动子，3′末端引入丁型肝炎病毒(HDV)核酶与牛生长激素(BGH)信号序列，构建的SVA全长感染性克隆pSVA-GX01(数据未发表)；
含有GFP基因的SVA重组质粒pSVA-GX01-GFP由本实验室构建与保存；
含有猪O型FMDV VP1蛋白基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组质粒pGXAM-12BS-FMDV-VP1-O由本实验室构建与保存；
仓鼠肾细胞BHK-21细胞由本实验室保存培养。

1.1.2 主要试剂 高保真DNA聚合酶PrimeSTAR®MAX DNA Polymerase、DNA标准DL 2 000、DNA标准DL 10 000，TaKaRa Bio公司产品；
高保真限制性核酸内切酶SpeⅠ-HF、BamHⅠ-HF、T4 DNA连接酶，New England Bio Labs公司产品；
胶回收试剂盒、反应液回收试剂盒、质粒小提试剂盒，Omega Bio-Tek公司产品；
大肠埃希氏菌感受态细胞DH5α，康为世纪生物科技有限公司产品；
转染试剂脂质体(Lipofectamine) 2 000，Invitrogen公司产品；
FITC标记的山羊抗兔IgG(H+L)和FITC标记的山羊抗鼠IgG(H+L)，北京全式金生物技术有限公司产品；
SVA VP1蛋白多克隆抗体由本实验室制备与保存[17]；
O型FMDV VP1蛋白多克隆抗体由本实验室制备与保存等。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪，ProFlex公司产品；
微量移液器、小型台式高速冷冻离心机，Eppendorf公司产品；
琼脂糖凝胶核酸电泳仪，北京六一生物科技有限公司产品；
凝胶成像仪，Bio-Rad公司产品；
精密恒温培养箱和振荡箱、二氧化碳培养箱，Thermo Fisher Scientific公司产品；
数显恒温水浴锅，邦西仪器科技有限公司产品；
显微镜、倒置荧光显微镜，Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参考O型口蹄疫病毒MYA/3/2010株的VP1基因序列(GenBank：JQ070319.1)，设计1对引物，上游引入SpeⅠ、下游引入BamHⅠ限制性核酸内切酶识别位点的引物，引物序列为：FMDV-VP1-O-F：5′-acgACTAGTaccacttcgacaggcgagtc-3′(下划线部分为SpeⅠ识别位点)；
FMDV-VP1-O-R：5′-cgtGGATCCcaaggactgcttcacaggtgcca-3′(下划线部分为BamHⅠ识别位点)；
参考杨彩娟等[18]设计1对SVA检测引物，序列为：SVA-2682-F：5′-TTCCACTCCACCGACAACG-3′；
SVA-3224-R：5′-GATACCTTCCCACCCTTGC-3′；
参考SVA CH-GX-01-2018(GenBank：MK039162.1)[16]的基因序列在插入位点两端设计1对引物用于鉴定重组病毒及测序，引物序列为：SVA-F：5′-GACTGGGGGACCATTTACGCCTTC-3′；
SVA-R：5′-TTGCATCTTGAACAACTTTCGGA-3′，上述引物由北京擎科生物科技有限公司南宁合成部合成。

1.2.2 O型口蹄疫病毒VP1基因的克隆 将质粒pGXAM-12BS-FMDV-VP1-O稀释1 000倍后以其为模板，使用PrimeSTAR MIX高保真DNA聚合酶和引物对FMDV-VP1-O-F、FMDV-VP1-O-R扩增，扩增体系为25 μL体系：PrimeSTAR MIX 12.5 μL，上、下游引物分别0.5 μL，模板DNA 3 μL，ddH2O补全至25 μL，配制两管共50 μL。PCR 扩增条件为：98 ℃预变性3 min；
98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 10 s，共32个循环；
继续延伸72 ℃ 10 min后经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，目的条带使用Omega Bio-Tek公司胶回收试剂盒纯化回收。

1.2.3 表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组SVA质粒的构建与鉴定 用SpeⅠ-HF和BamHⅠ-HF同时酶切pSVA-GX01-GFP和O型FMDV VP1回收产物，分别配制50 μL体系：SpeⅠ-HF 1 μL，BamHⅠ-HF 1 μL，Cutsmart buffer 5 μL，模板质粒pSVA-GFP/FMDV VP1回收产物15 μL，ddH2O补全至50 μL，37 ℃作用6 h以上，pSVA-GFP酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收SVA全长目的片段。O型FMDV VP1酶切产物直接纯化回收。二者回收产物通过T4连接酶16 ℃过夜连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞中，涂布含氨苄青霉素抗性LA平板培养,并挑取单克隆菌落摇菌培养后进行菌液PCR鉴定，阳性克隆大量扩繁后，菌液用Omega Bio-Tek公司质粒小提试剂盒提取质粒，经双酶切与广州华大生物科技有限公司测序进一步鉴定，正确的质粒命名为pSVA-FMDV-VP1-O。

1.2.4 表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组SVA的拯救与鉴定

1.2.4.1 重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O的拯救 将BHK-21细胞传至6孔板中，待细胞密度达70%～80%时，用脂质体2 000介导将pSVA-FMDV-VP1-O重组质粒转染至BHK-21细胞，同时设立亲本对照(pSVA-GX01)、脂质体对照和阴性细胞对照，置于体积分数为5%的CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，观察细胞状态及细胞病变情况，48 h后收取上清，重新感染新铺板的BHK-21细胞，直到能够稳定产生CPE，如细胞出现拉丝、变圆、脱落或空泡状等病变现象。将得到的重组病毒命名为rSVA-FMDV-VP1-O。

1.2.4.2 间接免疫荧光(IFA)鉴定SVA VP1抗原 当6孔板中的BHK-21细胞密度达70%～80%时，将P3代rSVA-FMDV-VP1-O以0.1 MOI接种，置于含体积分数为5%的CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，同时设立亲本病毒rSVA-GX01对照和阴性细胞对照。12 h～24 h弃上清，PBS洗涤3遍后用冰甲醇4 ℃固定30 min；
PBS洗涤3次后用10 mg/mL BSA室温封闭30 min；
PBS洗涤3次后SVA VP1兔多克隆抗体(1∶100稀释)，37 ℃孵育2 h；
PBS洗涤5次(微量振荡器，每次5 min)后加入FITC标记的山羊抗兔IgG(1∶500稀释)，室温避光孵育1 h，完成后用PBS洗涤5次(微量振荡器，每次5 min，注意避光)，结束后用荧光倒置显微镜在暗环境下观察结果。

1.2.4.3 间接免疫荧光(IFA)鉴定FMDV VP1表达 操作步骤同1.2.4.2，一抗改用实验室制备的O型FMDV VP1小鼠多克隆抗体，二抗为FITC标记的山羊抗鼠IgG。

1.2.4.4 重组病毒RT-PCR鉴定 收取P3代病毒上清液，用AxyPrep DNA/RNA小量提取试剂盒提取重组病毒总RNA，反转录成cDNA后用SVA特异性检测引物对SVA-2682-F和SVA-3224-R以及O型FMDV VP1特异性引物对FMDV-VP1-O-F和FMDV-VP1-O-R进行PCR鉴定。

1.2.5 重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O滴度测定 待96孔板中BHK-21细胞密度达80%左右时，取P3代rSVA-FMDV-VP1-O和亲本毒株rSVA-GX01病毒液连续倍比稀释(10-1～10-12)后100 μL/孔接种，每个稀释梯度8个重复，同时设置两列20 mL/L FBS DMEM作为阴性对照。将加好样的96孔板置于含体积分数为5%的CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，密切观察96孔细胞板中的细胞病变情况，记录出现细胞病变的孔，连续观察数天直至不再有新的细胞病变出现。统计每个稀释梯度出现病变的孔数，按照Reed-Muench法计算病毒的TCID50，试验设置3个重复取平均值。

1.2.6 重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O体外生长特性测定 以0.1 MOI的感染剂量将拯救病毒rSVA-FMDV-VP1-O和亲本病毒rSVA-GX01接种于铺有密度约80% BHK-21细胞的6孔板中，每种病毒设置3个重复，在接种后6、12、24、36、48、72 h分别收取细胞上清并测定其TCID50，具体操作步骤同1.2.5，根据所得结果绘制病毒的体外生长曲线。

1.2.7 重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O遗传稳定性鉴定 将重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O在BHK-21细胞上连续传至第10代，收集感染细胞上清保存备用。用AxyPrep DNA/RNA小量提取试剂盒提取传代3代、6代、9代的重组病毒上清的总RNA，将RNA反转录成cDNA后，使用FMDV VP1插入位置的SVA基因特异的上、下游引物SVA-F和SVA-R扩增插入的外源基因进行PCR鉴定，目的条带经Omega Bio-Tek公司胶回收试剂盒纯化回收后，送广州华大生物科技有限公司进一步测序鉴定。

2.1 表达O型口蹄疫VP1蛋白的重组SVA质粒的构建与鉴定

以质粒pGXAM-12BS-FMDV-VP1-O为模板，用设计的引物FMDV-VP1-O-F和FMDV-VP1-O-R扩增FMDV的VP1基因，通过SpeⅠ、BamHⅠ酶切位点将扩增的FMDV VP1基因基因替换GFP基因至SVA全长感染性克隆2A与2B基因之间，重组质粒构建示意图如图1。将得到的重组质粒命名为pSVA-FMDV-VP1-O，并使用SpeⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定及送广州华大生物科技有限公司进一步测序测定(结果未显示)，结果显示获得了正确的重组质粒。

图1 携带FMDV VP1 的SVA重组克隆构建策略

2.2 表达O型口蹄疫VP1蛋白的重组SVA病毒的拯救与鉴定

将重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O和亲本质粒pSVA-GX01转染至BHK-21细胞，48 h后收取上清，重新感染新铺板的BHK-21细胞，直到细胞稳定出现CPE，阴性对照无明显变化(图2A)。将得到的重组病毒命名为rSVA-FMDV-VP1-O。为鉴定拯救的重组病毒，用SVA VP1多克隆抗体做间接免疫荧光试验，结果如图2B所示，接种重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O和亲本毒株rSVA-GX01的样本都可观察到特异性荧光，而阴性对照无荧光产生，说明重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O可表达SVA VP1蛋白。用O型FMDV VP1多克隆抗体做间接免疫荧光试验，结果如图2C，接种重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O的样本能观察到特异性荧光，而接种亲本毒株rSVA-GX01的样本和阴性对照无荧光产生，说明重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O可表达FMDV VP1蛋白。最后，进一步对其用SVA特异性检测引物和O型FMDV VP1引物进行PCR鉴定，结果如图3。用SVA特异性检测引物以rSVA-GX01和rSVA-FMDV-VP1-O感染细胞上清制备的模板均能扩增出符合预期大小的特异性条带，而用O型FMDV VP1引物仅能以rSVA-FMDV-VP1-O感染细胞上清制备的模板扩增出符合预期大小的特异性条带。结果说明成功拯救到重组病毒，并且O型FMDV VP1可在细胞内表达。

图2 重组病毒感染细胞病变(A)和IFA鉴定SVA VP1蛋白(B)以及FMDV VP1蛋白(C)(20×)

2.3 重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O体外生长特性测定

通过对重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O与亲本毒株rSVA-GX01进行生长曲线的绘制(图4)，可以看出重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O滴度略低于亲本毒株rSVA-GX01，但差异不显著，2种病毒均在36 h左右达到峰值，说明重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O与亲本毒株rSVA-GX01在BHK-21细胞中具有相似的生长复制特性。

M.DNA标准DL 2 000；
1.rSVA-FMDV-VP1-O；
2.rSVA-GX01 M.DNA Marker DL 2 000；
1.rSVA-FMDV-VP1-O；
2.rSVA-GX01

图4 rSVA-FMDV-VP1-O和rSVA-GX01生长曲线

2.4 重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O遗传稳定性鉴定

分别抽提P3、P6、P9代重组病毒感染细胞上清液的总RNA，反转录后使用FMDV VP1插入位置的SVA基因特异的上、下游引物进行PCR鉴定，并用重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O为对照(图5)，P3和P6代rSVA-FMDV-VP1-O感染细胞上清均能检测到符合预期大小的与重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O一致的特异性条带，但以第9代病毒上清制备的模板能扩增出两个主要的特异性条带，一个条带与预期大小吻合，另外一个小于预期大小，将较小的特异性条带回收后送广州华大生物科技有限公司测序，结果显示FMDV VP1基因缺失约480 bp(结果未显示)，说明第9代重组病毒中外源基因已经开始缺失，重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O可在BHK-21细胞上稳定存在6代。

SVA是一种新发现的动物病原。2015年，我国广东省首次发现SVA感染病例[19]，其后陆续在其他省份都有报道[20-21]。有研究表明，除了猪是SVA易感动物外，多种动物都可感染SVA，如牛、鼠等，甚至在人体血清内也检测到过SVA中和抗体[22]，这说明SVA可潜在感染多种动物和人，已经成为临床上一种重要的传染病病原。

M.DNA标准DL 2 000；
1.P3代rSVA-FMDV-VP1-O；
2.P6代rSVA-FMDV-VP1-O；
3.P9代rSVA-FMDV-VP1-O；
4.pSVA-FMDV-VP1-O对照；
5.rSVA-GX01对照；
6.阴性对照

SVA 2A蛋白的C端具有小RNA病毒科的保守基序NPG↓P，其可能与核糖体跳跃机制相关，是一个理想的外源基因插入位点。有研究通过SVA反向遗传操作系统，将外源绿色增强荧光蛋白EGFP、荧光素酶等基因插入SVA基因组的2A与2B基因之间，构建的重组病毒均能成功表达出有活性的报告蛋白[14-15]，含有外源EGFP的重组SVA可在细胞上至少稳定传10代仍可表达绿色荧光[23]，这对于以SVA为载体表达其他病毒的外源基因提供了参考。

本研究将FMDV的主要中和性抗原蛋白VP1基因克隆进入SVA全长感染性克隆质粒，获得重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O，并通过病毒拯救得到了1株可表达O型FMDV VP1蛋白的重组塞内卡病毒rSVA-FMDV-VP1-O。对该重组病毒进行鉴定与体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析，O型FMDV的VP1蛋白在该重组病毒上成功表达，且插入的O型FMDV VP1蛋白基因可以在BHK-21细胞上稳定遗传6代，该重组病毒和亲本毒株具有相似的生长复制特性。O型FMDV VP1蛋白以SVA为载体的成功表达，进一步为SVA可在2A与2B基因之间插入外源基因提供了有力论证，也为其他传染病病原如猪圆环病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)等重要抗原基因的插入提供了一定的参考，为今后研发一种新型的基因工程活载体疫苗用于同时防控塞内卡病毒和口蹄疫病毒甚至其他多种病毒的免疫保护奠定了基础。

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