缺血性脑卒中分子流行病学筛查及其危险因素分析
时间：2023-06-19 12:25:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
闫 雯，赵于飞，宫玉哲，张小珍，韩树珍，李兴杰
兰州大学第二医院 健康管理中心，甘肃 兰州 730000
缺血性脑卒中是以局灶性神经功能缺失为共同特征的急性脑血管疾病，占脑卒中总发病率的80%[1]。有研究报道，缺血性脑卒中发病是遗传和环境因素共同作用的结果，高血压、糖尿病、冠心病、高同型半胱氨酸血症是其明确的危险因素[2-3]。但仍有许多影响因素与其发病关系尚未明确。近年来，全基因组关联分析作为分析人类复杂疾病的一种重要手段，已识别出众多与缺血性脑卒中或其危险因素相关的候选基因[4]。缺血性脑卒中涉及的易感基因较多，其发生、发展往往由多个基因共同作用。因此，临床对缺血性脑卒中遗传易感性的研究难以有突破性的进展。CDKN2B-AS1基因表达与心脑血管疾病关系密切[5]，但目前尚缺乏缺血性脑卒中分子流行病学的相关数据。本研究以缺血性脑卒中遗传学背景作为切入点，构建聚合酶链式反应-高分辨熔解曲线(PCR-HRM)对缺血性脑卒中患者进行基因分型，获取缺血性脑卒中遗传学数据，同时探索能够预测缺血性脑卒中发病的相关临床检测指标，筛选缺血性脑卒中的危险因素，为缺血性脑卒中的早期筛查提供依据。现报道如下。
1.1 研究对象 选取自2020年3月至2022年1月兰州大学第二医院收治的250例缺血性脑卒中患者纳入B组，另选取同期250例健康体检者纳入A组。纳入标准：(1)B组患者符合《2014年中国急性缺血性脑卒中诊治指南》[6]中缺血性脑卒中的诊断标准，首次发病，且经颅脑CT或磁共振确诊；
(2)年龄18～80岁；
(3)所有研究对象均知情同意。排除标准：(1)心源性脑栓塞、瘤性脑卒中、烟雾病或静脉窦血栓形成引起的脑卒中；
(2)恶性肿瘤；
(3)合并心、肝、肾重要脏器疾病；
(4)认知功能障碍及凝血功能障碍；
(5)临床资料缺失，未完成本研究。本研究经兰州大学第二医院伦理委员会批准。
1.2 研究方法
1.2.1 特异性引物设计 筛选易感基因。在NCBI的数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)SNP子库内对SNP位点全序列信息进行查询，标注该位点上下游200 bp内所有其他的突变，避开这些突变位点进行引物设计。引物设计使用在线软件Primer-BLAST，引物的有效性、特异性、可辨性和具体的Tm值(℃)通过Two-state melting、Primer-BLAST、Oligo Analyzer和uMelt等在线软件进行评价，初步评价可用后，由上海生工生物工程有限公司进行合成。引物的特异性和有效性通过后续预实验PCR扩增验证，扩增效果不理想时及时修正，最终获得最佳特异性引物。
1.2.2 PCR-HRM检测体系的建立与优化 基因组DNA提取使用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，严格按照说明书操作。提取的基因组DNA具体纯度和浓度采用微量蛋白核酸检测仪(Nano-drop 2000)进行检测，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。PCR扩增和HRM检测使用梯度PCR仪(北京东胜创新生物科技有限公司，型号EDC-810)及高分辨的实时荧光定量PCR仪(美国凯杰公司，Rotor-Gene Q)完成，通过预实验优化反应条件，扩增完成后通过琼脂糖凝胶电泳和全自动凝胶成像仪进行PCR产物的特异性检测。
1.2.3 PCR-HRM检测体系检验性能评价 通过灵敏度、特异性、重复性、再现性和准确性对上述检测方法进行检验性能评价。通常将突变基因型定义为阳性，野生基因型定义为阴性。随机挑选50例标本进行PCR-HRM基因分型，通过Sanger测序评估其准确性，并计算特异性和灵敏度。采用批内10次重复实验评估重复性，即选取确定的纯合突变型和野生型标本各2例，每个标本在同1个批次内重复10管；
采用批内10次重复实验评估再现性，即随机挑选10个样本，每天1次，不间断地实施10 d检测；
计算2种基因型的Tm值平均值、变异系数(CV)和标准差。
特异性=真阴性/(假阳性+真阴性)×100%
灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%
1.3 观察指标 评价遗传分子标志物的疾病预测价值，通过多因素Logistic回归分析筛选出缺血性脑卒中的危险因素，分析SNP基因型突变与缺血性脑卒中的相关性。比较各基因型缺血性脑卒中指标，包括空腹血糖、甘油三酯、糖化血红蛋白。
2.1 单因素分析结果 两组性别、职业比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组年龄、体质量指数、高血压史、糖尿病史、高脂血症、脑卒中家族史、基因型分布比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 单因素分析结果/例(百分率/%)
2.2 多因素Logistic回归分析结果 以年龄、体质量指数、高血压史、糖尿病史、高脂血症、脑卒中家族史、基因型分布为自变量，以是否有缺血性脑卒中为因变量，进行多因素Logistic回归分析。高血压、高脂血症、脑卒中家族史及基因型分布是缺血性脑卒中的独立危险因素(P<0.05)。见表2。
2.3 Hardy-Weinberg遗传平衡检验CDKN2B-AS1基因的10个SNP位点(包括rs10116277、rs10738607、rs564398、rs10757269、rs496892、rs4977574、rs1537375、rs2184061、rs7044859和rs2383207)均有3个基因型(GG、GA、AA；
AA为野生型，GA为杂合突变型，GG为纯合突变型)。两组上述位点各基因型的期望值与观测值均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。
表2 多因素Logistic回归分析结果
2.4CDKN2B-AS1基因多态性与缺血性脑卒中的相关性 两组CDKN2B-AS1基因rs10116277、rs10738607、rs564398、rs10757269、rs496892、rs4977574、rs1537375、rs2184061和rs2383207位点基因型分布比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；
而CDKN2B-AS1基因rs7044859位点多态性与缺血性脑卒中具有相关性(P<0.05)，其共显性模型(GG/AA)、显性模型(GG/GA+AA)与隐性模型(AA/GA+GG)的粗OR(ORc)分别为2.486(95%可信区间1.368～4.453)、1.873(95%可信区间1.179～2.975)、0.525(95%可信区间0.313～0.882)。
2.5CDKN2B-AS1基因多态性rs7044859位点突变频率分析 两组 rs7044859的GG、AA基因型分布频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；
两组rs7044859的GA基因型分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)；
B组等位基因G频率为89.2%(223/250)，明显高于A组的68.4%(171/250)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 两组rs7044859位点基因型比较/例(百分率/%)
2.6 rs7044859位点基因型与缺血性脑卒中的相关性 以突变基因型为自变量，Logistic回归分析结果显示，rs7044859位点基因多态性与缺血性脑卒中独立相关(P<0.05)。见表4。
表4 rs7044859位点基因型与缺血性脑卒中的相关性
2.7 各基因型缺血性脑卒中指标比较 AA型甘油三酯水平低于GG型、GA型，且GA型低于GG型，差异均有统计学意义(P<0.05)。AA型糖化血红蛋白水平高于GG型，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表5 各基因型缺血性脑卒中指标比较
脑卒中是脑部血管突然破裂或脑部血管阻塞造成血液循环障碍引起的脑组织损伤，包括出血性脑卒中和缺血性脑卒中[7]。其中，缺血性脑卒中发病快速且凶险，预后不良，严重威胁患者生命健康[8]。缺血性脑卒中发病危险因素分为可干预因素与不可干预因素，可干预因素包括血糖、血脂异常、高血压、冠心病、高同型半胱氨酸血症、不良生活习惯与饮食习惯等[9]；
不可干预的因素包括年龄、性别、种族和遗传因素[10]。对缺血性脑卒中进行早期预防，是降低患者发病率和病死率的根本途径。
本研究结果显示，高血压、高脂血症、脑卒中家族史及基因型分布是缺血性脑卒中的独立危险因素(P<0.05)。高脂血症患者脂质沉积于血管壁，会加速血管粥样硬化斑块的产生，使血管更为狭窄，最终造成血栓形成[11-12]。长期的高血压会损害脑血管，导致血管发生玻璃样变，诱发脑梗死[13-15]。此外，脑卒中家族史提示此疾病具有显著性基因风险。
PCR-HRM作为一种突变扫描和基因分型技术，不受突变的位点及类型限制，灵敏度和特异性较高，无需特异性的探针，操作简便、快速高效、成本低廉且全程闭管操作，是疾病遗传学研究的理想方法。CDKN2B-AS1基因表达与心脑血管疾病的发病相关。在外周血的单核巨噬细胞中，CDKN2B-AS1基因的高表达能够加速细胞增殖，并增加其粘附力，导致动脉粥样硬化的风险增加。本研究筛选10个CDKN2B-AS1基因位点，发现rs7044859位点多态性与缺血性脑卒中具有相关性(P<0.05)；
两组rs7044859的GG、AA基因型分布频率比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；
B组等位基因G频率明显高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。这提示，CDKN2B-AS1基因位点rs7044859多态性和缺血性脑卒中关系密切，携带等位基因G的人群更易患缺血性脑卒中。此外，rs7044859多态性与血糖水平关系密切，高空腹血糖会增加缺血性脑卒中的发病风险。有研究报道，糖代谢异常是缺血性脑卒中发病的独立危险因素[16-17]。相关研究证实，在缺血性脑卒中的诊治期间，糖化血红蛋白、甘油三酯等生化指标可有效地预测、评估缺血性脑卒中严重程度和预后[18]。另有研究发现，携带等位基因G的患者更易出现血糖水平升高[19]，CDKN2B-AS1基因rs4977574位点和血糖代谢相关，提示等位基因G可能会影响缺血性脑卒中的发病[20]。
综上所述，高血压、高脂血症、脑卒中家族史及基因型突变型分布是缺血性脑卒中的危险因素，CDKN2B-AS1基因位点rs7044859基因型与缺血性脑卒中具有相关性，临床可参考基因型分布特点积极预测并干预缺血性脑卒中。
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