NMI通过NF-κB信号通路促进急性胰腺炎炎症反应
时间：2023-06-17 19:20:05 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
吴浪,陈升鑫,张贯军,张大涯,陈德鑫,李明阳
【提要】目的 急性胰腺炎是消化系统常见的急腹症，患病率高，治疗方法有限，发病机制复杂。本研究的目的是确定急性胰腺炎发病中可靠的差异表达基因和潜在的致病机制，丰富急性胰腺炎的研究，为未来在治疗上提供更多的参考价值和依据。方法 从GEO数据库获得高通量数据集GSE194331和GSE109227的全基因组表达谱，找出表达值高且存在共表达的差异表达基因，再对这些基因蛋白质-蛋白质相互作用网络构建，筛选出存在关联的50个基因，进一步对这些基因进行基因本体和KEGG通路富集分析。接下来，从中挑出一个目标基因NMI进行实验验证。首先，收取急性胰腺炎患者的血液样本验证NMI的激活。然后，用雨蛙素对野生小鼠造急性胰腺炎模型验证NMI的活化。最后，通过NMI基因敲除小鼠验证NF-κB信号通路。结果 从数据集中筛查出246个共表达的差异基因，其中50个基因在蛋白互作网中存在着关联性，基因富集分析表明这些基因主要参与了NF-κB、TLR和MAP多条信号传导通路。实验也验证了从中挑选出的NMI基因在急性胰腺炎患者和野生鼠的胰腺炎模型中激活，并且NMI基因敲除后，小鼠胰腺组织的NF-κB/p65的基础表达水平明显降低，磷酸化NF-κB/p65在NMI KO胰腺炎组小鼠中活化水平明显低于野生胰腺炎组。NMI KO胰腺炎组中胰腺腺泡的损伤程度比野生胰腺炎组低。结论 NMI可通过NF-κB信号通路促进急性胰腺炎的损伤过程。
急性胰腺炎是消化系统一种常见得到急腹症，它是胰酶激活引起自身组织消化而导致的内源化学性炎症反应。胆结石和高脂血症是急性胰腺炎的两大病因，酗酒和暴饮暴食被公认为最常见的诱因[1-3]。尽管大多数急性胰腺炎表现为轻症，但病情进展时可累及全身脏器衰竭，发展为重症急性胰腺炎，死亡率可高达50%以上，占胰腺炎总死亡率的2%～5%[4]，在临床上主要以对症支持治疗为主，尚无特效药物控制病情。虽然有不少关于急性胰腺炎药物及治疗方面的研究，Parabacteroides[5]、Isoliquiritigenin[6]、Wedelolactone[7]和西格列汀[8]等均能减轻急性胰腺炎的炎症反应，但其临床疗效并未得到验证。
大量的科研成果证实了急性胰腺炎的发病机制与基因的多态性有关，如PRSS1[9]，DPPIV[10]，TPH1[11]等。并且研究表明多条信号通路参与了急性胰腺炎的发病过程，p62-Keap1-Nrf2[8],JAK2/STAT3[12],JNK[13],NF-κB[14]和p38/MAPK[15]等通过不同的作用机制发挥着不可替代的作用。最新证据揭示铁死亡和细胞焦亡也参与了急性胰腺炎的致病机制[7, 16]。然而，大部分研究是在动物诱导模型的背景下模拟进行的，如雨蛙素[9]、脂多糖[17]、牛磺石胆酸硫酸盐[18]等诱导小鼠急性胰腺炎模型，其机制研究到底有多少是与人类急性胰腺炎的发病机制是一致的，我们不得而知。
在本研究中，我们应用生物信息学的方法，以基于来自公共数据库的高通量测序结果，综合分析了人类和小鼠急性胰腺炎模型的全基因组测序的共同差异基因表达和信号通路分析，并筛选其中一个基因进行实验验证，阐明相关基因在急性胰腺炎中的致病机制，希望未来为靶向药物的研究提供新的证据。
1.1 数据采集和处理
GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)是一个注释非常丰富的综合数据库，我们从GEO数据库筛选出GSE194331和GSE109227数据集。数据集GSE194331基于平台GPL16791(Illumina HiSeq 2500),包括32名健康对照组，57名轻症急性胰腺炎，20名中重症急性胰腺炎，10名重症急性胰腺炎患者。从中获得了急性胰腺炎外周血的RNA-Seq数据，包括矩阵文件数据和补充文件数据。然后根据样本编号、疾病编号和基因表达情况逐一进行核对，以确保个体中的基因表达谱对应正确的患者。在这项研究中，我们选择了轻症急性胰腺炎的样本数据。数据集GSE109227基于平台GPL6246(Affymetrix Mouse Gene 1.0 ST Array)，包括5只注射氯化钠的野生型小鼠作为对照，5只腹腔注射雨蛙素诱导急性胰腺炎的小鼠胰腺作为实验组。
1.2 数据处理及差异基因的识别
数据集GSE194331和GSE109227的原始数据从GEO数据库下载，GSE194331通过R包进行处理,先对数据集进行基因名转换，并去掉缺失值，选出平均值大于100的基因。GSE109227数据集通过GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?acc=GSE109227)进一步处理。两个数据集均进行质量归一化，|log2倍数变化 (log2FC)|>log21.5和P<0.05被设置为筛选差异表达基因的标准。用R包绘制韦恩图。
1.3 差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络构建
STRING[19]在线工具(https://cn.string-db.org/)是用于检索相互作用基因的搜索工具，它可以用来探索差异基因编码蛋白质之间的相互关系以及差异基因的蛋白质-蛋白质相互作用网络，综合得分>0.7且节点之间存在着关联被认为是有意义的，并被映射到网络中。接下来，用Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用网络，并对存在着关联的基因用R包绘制热图。
1.4 功能富集分析
DAVID[20]数据库 (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)是一个集注释、可视化和集成在线工具，它为科研人员提供了全面的注释信息以了解基因的背后的生物学意义。在该研究中，我们引入了DAVID数据库对已识别基因的功能注释和通路分析，选择P值<0.05且FDR<0.05作为富集项阈值，获取了基因本体和京都基因与基因组百科全书通路中的差异基因富集结果。用R包作图可视化分析。
1.5 试剂和材料
酶联免疫试剂盒人源NMI、小鼠NMI和小鼠IL-18从华美(武汉，中国)获得，酶联免疫试剂盒小鼠IL-18和IL-1β购买于R&D system (Minneapolis, MN, 美国)，IL-雨蛙素来自于MedChemExpress (New Jersey, 美国)。NF-κB p65抗体从Abcam(Cambridge, MA, 美国)购置，anti-rabbit-IgG和anti-mouse IgG从Cell Signaling (Beverly, MA, 美国)购买，GAPDH 抗体来自于TRANS (北京,中国)。
1.6 人血液样本实验验证
轻症急性胰腺炎患者(32名)的血液样本从解放军总医院第一医学中心就诊的患者中采集，健康志愿者(16名)的血液样本作为对照。静置、4 ℃ 3 000 rpm 离心5分钟，分离血浆并储存于-80 ℃，用Elisa法检测NMI、IL-1β和IL-18水平。知情同意书经中国人民解放军总医院医学伦理委员会批准，S2021-612-03).
1.7 野生型小鼠实验验证
从SPF (Beijing) 生物技术有限公司购买C57BL/6种系野生小鼠，体重18～25 g，雌雄不分，所有小鼠均喂食标准啮齿动物饲料和清水，动物实验申请获得了中国人民解放军总医院动物伦理委员会批准(SQ2021299)，所有小鼠均在麻醉状态下脱颈处死。用双蒸水稀释雨蛙素(浓度：10 μg/mL，pH约7.0)。将小鼠随机分为2组，每组6只：对照组(不处理)，急性胰腺炎组(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)。在第7小时，麻醉状态下进行眼球取血，并置于涂有EDTA的EP管，将血液样本在4 ℃ 3 000 rpm 的条件下离心5分钟，取血浆进行淀粉酶、脂肪酶、NMI和炎症因子水平检测.
1.8 NMI基因敲除小鼠验证NF-κB信号通路
以C57BL/6种系野生小鼠为背景，进行NMI基因整体敲除，对雌性C57BL/6超排卵后与雄性C57BL/6小鼠交配并收集输卵管中的受精卵。将Cas9 mRNA (150 ng mL-1) 和转录的sgRNA (100 ng mL-1) 混合并在M2培养基 (Sigma，M7167, 100 mL) 中显微注射到具有状态良好的核仁的受精卵的细胞质中。将小鼠分为4组，体重18～25 g，雌雄不分，每组6只：野生对照组(不处理)，NMI KO对照组(不处理)，野生急性胰腺炎组(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)，NMI KO急性胰腺炎组(雨蛙素50 μg/kg/h，腹腔注射，6次)。在第7小时，进行眼球取血，并置于涂有EDTA的EP管，将血液样本在4 ℃ 3 000 rpm 的条件下离心5分钟，取血浆进行淀粉酶、脂肪酶和炎症因子水平检测。取每只小鼠胰腺组织，分两份，一份置于-80℃用于提取蛋白，一份固定于多聚甲醛用于蜡片包埋。
1.9 组织蛋白质印迹
为了评估组织中的特定蛋白质活性，我们研磨了小鼠胰腺组织，并使用NP40提取了总蛋白质。在蛋白质定容定量和变性后，用十二烷基硫酸钠 - 聚芳酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳并转移到膜上，用脱脂牛奶封闭1 h后，检测GAPDH和NF-κB/P65的特异性抗体。
1.10 组织病理学分析
将胰腺组织固定在4%多聚甲醛(PFA)中，包埋在石蜡中，切成5 μm片，然后用苏木精和伊红(HE)染色(北京瑞博科技有限公司)。在×200放大倍率的光学显微镜下观察组织的病理改变。
2.1 差异基因的识别
从GSE194331数据集下载了119个样本急性胰腺炎患者的RNA-Seq信息，其中轻度急性胰腺炎患者57名。对所有样本的基因表达值用R包进行分析。用EdgeR统计方法分析差异表达基因。我们使用GEO2R工具处理GSE109227数据集并进行归一化后，筛选出了3080个基因上调，2457个基因下调。图1A为数据集GSE194331和GSE109227的差异表达基因的韦恩图。其中有246个为在两个数据集中共表达的基因。接下来，使用STRING在线工具(https://cn.string-db.org/)和Cytoscape软件，将246个有差异的共表达转录因子过滤到PPI网络中，组合得分大于0.7，并且在Cytoscape中存在着关联的基因包含50个节点，69条边(图1B)。一个节点代表网络中的一个基因，边代表基因之间的相互作用。
图1C为该50个基因在数据集GSE194331的轻症急性胰腺炎血液样本中的表达热图。
图1 从GSE194331和GSE109227高通量数据集中鉴定差异表达基因 A：
GSE194331数据集急性胰腺炎血清样本高通量测序中差异表达基因的火山图；
B：GSE109227数据集小鼠急性胰腺炎模型胰腺组织高通量测序中差异表达基因的火山图。蓝色图表示高表达水平的基因，红色图表示低水平表达的基因，灰色表示没有差异表达的基因；
C：
GSE194331和GSE109227数据集与转录因子重叠的基因的韦恩图；
D：GSE194331和GSE109227数据集与转录因子重叠的共同的差异表达基因的韦恩图
2.2 通路富集分析
为了研究我们筛选出来的差异表达基因的功能注释，我们通过DAVID数据库对共表达的50个差异转录因子进行了功能富集分析。图2A显示了三类GO术语生物过程的气泡图，气泡的颜色表现P值，大小表示与差异基因的计数成正比。生物过程中富含差异表达基因的GO术语主要为炎症反应。图2B显示KEGG通路富集分析表明这些差异表达基因参与了多条信号传导通路，包括NF-κB、TLR和MAPK。
图2 差异表达基因的功能及通路富集分析 A：生物过程；
B：KEGG通路。点的大小代表富集的差异基因数量,颜色代表P值
2.2.1 基因NMI的急性胰腺炎患者中激活 在急性胰腺炎患者的血浆样本中，NMI的水平显著高于正常对照组(图3A)，并且炎症因子IL-1β和IL-18的释放明显增多(图3B)。这表明NMI在急性胰腺炎患者血液样本中激活，并能促进急性胰腺炎的炎症反应。
图3 急性胰腺炎患者中细胞因子的活化情况 A：血浆NMI激活；
B：血浆IL-18和IL-1β水平
2.2.2 基因NMI的急性胰腺炎小鼠模型中激活 雨蛙素诱导了小鼠急性胰腺炎模型，在急性胰腺炎小鼠的血浆中，淀粉酶和脂肪酶水平明显升高(图4A)，这表明我们的胰腺炎造模成功。并且，NMI的表达水平显著上升(图4B)，炎症因子IL-1β和IL-18的释放明显增加(图3C)。这与我们在急性胰腺炎患者血液样本中验证的结果一致。
图4 急性胰腺炎野生小鼠模型中细胞因子的释放情况 A：血浆淀粉酶和脂肪酶水平；
B：血浆NMI激活；
C：血浆IL-18和IL-1β水平
2.2.3 NMI基因敲除鼠构建 NMI基因敲除小鼠构建使用CRISPR-Cas9技术制备，NMI的sgRNA序列是AAAACAAAGAACTAGACGAGG[21]。图5为NMI-/-小鼠基因组的缺失和移码突变的结果验证。
图5 使用CRISPR-Cas9技术制备NMI敲除基因小鼠，显示了NMI-/-小鼠基因组的缺失和移码突变
2.2.4 NMI KO小鼠验证信号通路 NMI基因敲除降低了淀粉酶、脂肪酶和炎症因子的基础表达水平，但在急性胰腺炎的小鼠中，只有淀粉酶的水平明显低于野生型小鼠(图6A)，其余因子并未表现出明显的统计学差异(图6B)。同时，我们取小鼠的胰腺组织匀浆提取蛋白进行免疫印迹实验后，发现NF-κB/p65的基础表达水平在NMI KO小鼠明显降低。虽然在胰腺炎的小鼠胰腺组织中，P-NF-κB/p65出现明显的活化，但NMI KO组中，P-NF-κB p65的活化明显不如野生小鼠组(图6C)。从胰腺的病理组织切片，我们发现NMI KO 小鼠的胰腺组织腺泡细胞损伤程度低于野生小鼠胰腺组织(图6D)。这表明NMI基因敲除后，虽然不影响炎症因子的释放，但是NF-κB/p65的表达及激活受到了抑制，NMI可能通过NF-κB信号通路参与急性胰腺炎的炎症过程。
图6 与野生型小鼠相比，NMI KO小鼠细胞因子和相关蛋白的表达情况 A：血浆淀粉酶和脂肪酶水平；
B：血浆IL-1β和IL-18 的水平；
C：免疫蛋白印迹检测NF-κB的表达情况；
D：通过H&E染色确定胰腺损伤，黑色箭头代表腺泡细胞变性，黄色箭头代表腺泡细胞坏死，蓝色箭头代表自噬腺泡细胞 (×200)
在这项研究中，我们用了人和小鼠高通量测序的信息，共鉴定出246个符合筛选条件的共同差异表达基因，50个基因存在蛋白质互作关联，对这些基因进行通路富集分析，我们发现不少基因富集在NF-κB信号通路上。在我们用实验进行验证其中的NMI基因和通路时，结论与我们先前的分析不谋而合。因此，我们有理由地认为NMI在急性胰腺炎中通过NF-κB通路介导炎症反应。
NF-κB是核转录因子，调节这大多数基因的表达，它在细胞凋亡的调节、病毒复制、肿瘤发生、炎症和各种免疫性疾病中起着关键的作用。有研究表明[22]G 蛋白偶联受体信号传导的调节剂和介质β-Arrestins能够通过抑制NF-κB p65的激活来减轻急性胰腺炎，多巴胺通过抑制NF-κB通路减轻了胆囊收缩素刺激的胰腺腺泡细胞的炎症[23]，并且血管紧张素转换酶 (ACE)2-血管紧张素-(Ang)-(1-7)-Mas轴通过抑制p38 MAPK/NF-κB信号通路显著抑制胰腺炎[24]，虫草素也能通过 AMPK 抑制NF-κB和NLRP3 炎性体激活来缓解急性胰腺炎带来的损伤[25]。朱等人[26]的研究表明p21激活激酶 1(PAK1)在急性胰腺炎小鼠模型的胰腺中上调，从而激活NF-κB和p38通路，抑制PAK1降低NF-κB和p38的活性，减轻小鼠模型胰腺的病理损伤和炎症因子的水平。双链 RNA 依赖性激酶(PKR)促进NF-κB 的激活和促炎因子的产生，它加速了急性胰腺炎中的炎症反应和胰腺细胞损伤[27]。lncRNA母源表达基因3(MEG3)通过介导 HPDE 细胞中的 NF-κB 通路靶向 miR-195-5p/FGFR2 调节轴，参与雨蛙肽诱导的炎症损伤[28]。
在本研究中，我们发现敲除NMI基因后，雨蛙素造模的轻症急性胰腺炎小鼠的胰腺组织中NF-κB/p65的活化明显受到了抑制，胰腺组织的病理损伤有所减轻，淀粉酶的释放水平明显减少，但血液中脂肪酶和炎症因子的水平确没有明显的变化。NMI作为程序性细胞损伤应答因子，它对急性胰腺炎的致病机制是否与病情的严重程度有关，值得我们进一步探讨。
综上所述，NMI可通过NF-κB信号通路促进急性胰腺炎的损伤过程。
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