基于miR-34a-5p/SIRT1通路探讨壮医药线点灸治疗偏头痛模型大鼠的作用机制

范小婷 ，沈小淞 ，施学丽 ，刘姣 ，梁弘 ，赵明阳 ，林辰

1.广西中医药大学壮医药学院，广西 南宁 530001；

2.广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；
3.广西中医药大学研究生院，广西 南宁 530001

偏头痛是一种以头部疼痛为主症，伴发恶心、呕吐等自主神经功能障碍的慢性神经血管性疾病[1]。有文献报道，按失能所致生命年损失计算，偏头痛为我国第5位致残性疾病，其高发病率及致残率对患者生活质量造成巨大影响[2]。现代医学治疗偏头痛多以缓解疼痛为主，但所用药物对消化系统、心血管系统等有一定不良反应[3]。壮医药线点灸具有降低炎症、提高机体免疫功能作用[4-5]，对偏头痛防治有独特优势[6]。三叉神经血管系统（TGVS）激活引起的神经源性炎症反应是偏头痛发病的关键环节[7]，miR-34a与炎症反应关系密切，其高表达可促进炎症发展[8]。沉默信息调节因子（SIRT）1是组蛋白修饰的去乙酰化酶，通过去乙酰化核因子（NF）-κB发挥抗炎作用[9]，是miR-34a的靶基因[10]。研究发现，miR-34a-5p/SIRT1通路介导偏头痛发病过程，调控miR-34a-5p/SIRT1通路，抑制乙酰化NF-κB p65（Ac-NF-κB p65）表达可缓解大鼠偏头痛[11]。壮医药线点灸能调控SIRT1/NF-κB通路[12]。本研究以硝酸甘油诱导偏头痛模型大鼠为研究对象，观察壮医药线点灸对脑组织miR-34a-5p/SIRT1信号通路的影响，揭示其治疗偏头痛的作用机制。

1.1 动物与分组

SPF级雄性SD大鼠40只，体质量（200±25）g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019-0014。饲养于广西中医药大学实验动物中心清洁级动物房，室温（23±2）℃，湿度50%～65%，12 h明暗交替，自由摄食饮水。本实验相关操作均按照《关于善待实验动物的指导性意见》有关规定进行，并通过广西中医药大学实验动物福利伦理委员会审批（DW20211224-222）。

1.2 主要试剂与仪器

硝酸甘油注射液（山西康宝生物制品股份有限公司，批号200707L2641），SIRT1抑制剂EX-527（美国Selleck，批号S1541），降钙素基因相关肽（CGRP）、NF-κB、肿瘤坏死因子（TNF）-α ELISA Kit（武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号均为20220410），RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司，批号20220310），SIRT1抗体（北京索莱宝科技有限公司，批号20220413），Ac-NF-κB p65抗体（江苏亲科生物研究中心有限公司，批号AF3795），NF-κB p65抗体、TNF-α抗体（武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号20211210、20210910），反转录试剂盒、荧光定量mix（武汉莫纳生物科技有限公司，批号140609、140450），TUNEL试剂盒（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号MPC2103014）。酶标分析仪（南京德铁，型号HBS-1096A），低温离心机（德国Eppendorf，型号5418R），多功能酶标仪（美国MD，型号FilterMax F3），蛋白转印模块（美国Bio-Rad，型号Mini Trans-Blot Cell），凝胶成像系统（上海碧云天生物技术有限公司，型号EI600C），荧光定量PCR仪（瑞士Roche，型号Light Cycler®96），病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号RM2016），石蜡包埋机（武汉俊杰电子有限公司，型号JB-P5），显微镜、成像系统（日本尼康，型号E100、DS-U3）。

1.3 分组及造模

大鼠适应性饲养1周后，随机分为空白对照组、模型对照组、点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组，每组8只。参考文献[13-14]建立偏头痛大鼠模型，分别于第1、5、9、13、14日颈部皮下注射硝酸甘油注射液10 mg/kg，空白对照组注射0.9%氯化钠注射液10 mg/kg，共5次。大鼠注射后出现前肢频繁挠头、双耳发红、咬尾、爬笼次数增多、往返运动增多、烦躁不安等行为提示造模成功[15-16]。

1.4 干预

第1日造模成功30 min后开始干预，点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组选取大鼠“合谷”（双）、“太冲”（双）和“脐环穴”[17-19]，脐环穴3穴、6穴、9穴、12穴分别位于肚脐正左方、正下方、正右方和正上方（旁开2.5 mm）。将大鼠固定于特制鼠板，剃除穴位处毛发，将壮医药线（直径0.7 mm）点燃，待火候形成珠火，立刻用轻手法施灸于穴位上，火灭即起为1壮，每穴点灸2壮，每日1次，连续14 d；
点灸+EX-527组于点灸后腹腔注射EX-527（5 mg/kg）[20]；
点灸+生理盐水组于点灸后腹腔注射生理盐水（5 mg/kg）。空白对照组和模型对照组仅固定，不干预。

1.5 取材

第14日对大鼠进行行为学评分后，2%戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉，快速腹主动脉采血5 mL，3 000 r/min离心10 min，收集血清，-20 ℃冰箱保存备用。将大鼠断头处死，冰上分离中脑导水管周围灰质区，沿矢状位平均分成2部分：一部分于-80 ℃冰箱保存，用于Western blot、qPCR检测；
另一部分用4%多聚甲醛固定后，制作石蜡切片，用于HE染色和TUNEL染色。

1.6 指标检测

1.6.1 行为学评分

第14日干预后对大鼠进行行为学评分[21]。记录各组大鼠挠头、咬尾、爬笼、往返运动次数，每个行为出现1次计1分。

1.6.2 ELISA检测

根据ELISA试剂盒说明书进行操作，测定各组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量。

1.6.3 qPCR检测

取中脑组织20 mg加入1 mL Trizol，低温研磨机研磨，加入氯仿200 μL漩涡震荡30 s，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，沉淀、干燥RNA后，DEPC水溶解，酶标仪测定浓度和纯度。配制反转录体系，反转录得到cDNA，用cDNA作为扩增模板，配制20 μL PCR体系。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性15 s，60 ℃退火/延伸30 s。采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

1.6.4 Western blot检测

取中脑组织剪碎，每20 mg组织加入200 μL裂解液，低温高速组织研磨仪研磨，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清，BCA试剂盒测定蛋白浓度。快速凝胶制备试剂盒制胶，加样，电泳，转膜，PVDF膜放入快速封闭液中封闭30 min，分别置于SIRT1一抗（1∶1 000）、Ac-NF-κB p65一抗（1∶1 000）、NF-κB p65一抗（1∶2 000）、TNF-α一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶2 000）中，4 ℃摇床孵育过夜。TBST洗膜，将膜放入HRP标记山羊抗兔二抗（1∶10 000）中，37 ℃摇床孵育1 h。TBST洗膜，ECL超敏化学发光液浸泡，凝胶成像系统显色，Image J软件分析条带灰度值。

1.6.5 HE染色

石蜡切片65 ℃烤片2 h，脱蜡至水，滴加苏木素染液染色5 min，自来水浸泡，分化，返蓝，水洗，滴加伊红染液染色5 min，无水乙醇脱水，中性树胶封片，显微镜下观察中脑组织病理变化。

1.6.6 TUNEL染色

根据凋亡试剂盒说明书进行TUNEL染色，光学显微镜下采集图像，细胞核棕黄色代表凋亡细胞，每张切片随机选取5个不重叠视野，用CMIAS图像分析系统计算凋亡细胞数。

1.7 统计学方法

2.1 壮医药线点灸对模型大鼠行为学评分的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠行为学评分明显升高（P＜0.01）；
与模型对照组比较，点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组大鼠行为学评分明显降低（P＜0.05）；
与点灸组比较，点灸+EX-527组大鼠行为学评分明显升高（P＜0.05）；
与点灸+EX-527组比较，点灸组+生理盐水组大鼠行为学评分明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠行为学评分比较（，分）

表2 各组大鼠行为学评分比较（，分）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；
与模型对照组比较，#P＜0.05；
与点灸组比较，△P＜0.05；
与点灸+EX-527组比较，&P＜0.05

评分组别 只数12.13±1.64 43.88±4.19**27.63±2.39#33.25±3.28#△27.50±3.38#&空白对照组模型对照组点灸组点灸+EX-527组点灸+生理盐水组8 8 8 8 8

2.2 壮医药线点灸对模型大鼠血清降钙素基因相关肽、核因子-κB、肿瘤坏死因子α含量的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明显增加（P＜0.01）；
与模型对照组比较，点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明显减少（P＜0.05）；
与点灸组比较，点灸+EX-527组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量明显增加（P＜0.05）；
与点灸+EX-527组比较，点灸组+生理盐水组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α 含量明显减少（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量比较（）

表3 各组大鼠血清CGRP、NF-κB、TNF-α含量比较（）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；
与模型对照组比较，#P＜0.05；
与点灸组比较，△P＜0.05；
与点灸+EX-527组比较，&P＜0.05

组别TNF-α/（pg/mL）只数CGRP/（pg/mL）NF-κB/（μmol/L）空白对照组模型对照组点灸组点灸+EX-527组点灸+生理盐水组54.01± 9.01 151.14±21.58**85.06± 9.09#104.15±17.26#△89.21± 8.25#&8 8 8 8 8 104.87±12.45 248.02±22.84**151.65±12.81#194.69±28.75#△149.69±18.68#&32.54± 4.55 93.66±11.30**51.69± 6.53#66.29± 8.40#△47.83± 4.96#&

2.3 壮医药线点灸对模型大鼠中脑组织miR-34a-5p、沉默信息调节因子1、核因子-κB p65 mRNA表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠中脑组织miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表达升高（P＜0.01），SIRT1 mRNA表达降低（P＜0.01）；
与模型对照组比较，点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组大鼠中脑组织miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表达降低（P＜0.05），SIRT1 mRNA表达升高（P＜0.05）；
与点灸组比较，点灸+EX-527组大鼠中脑组织miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表达升高（P＜0.05），SIRT1 mRNA表达降低（P＜0.05）；
与点灸+EX-527组比较，点灸组+生理盐水组大鼠中脑组织miR-34a-5p、NF-κB p65 mRNA表达降低（P＜0.05），SIRT1 mRNA表达升高（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠中脑组织miR-34a-5p、SIRT1、NF-κB p65 mRNA表达比较（）

表4 各组大鼠中脑组织miR-34a-5p、SIRT1、NF-κB p65 mRNA表达比较（）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；
与模型对照组比较，#P＜0.05；
与点灸组比较，△P＜0.05；
与点灸+EX-527组比较，&P＜0.05

组别空白对照组模型对照组点灸组点灸+EX-527组点灸+生理盐水组NF-κB p65 1.01±0.16 2.11±0.23**1.25±0.13#1.55±0.16#△1.30±0.14#&只数8 8 8 8 8 miR-34a-5p 1.01±0.11 1.89±0.24**1.32±0.15#1.63±0.17#△1.33±0.12#&SIRT1 1.01±0.14 0.37±0.05**0.76±0.12#0.62±0.08#△0.74±0.10#&

2.4 壮医药线点灸对模型大鼠中脑组织沉默信息调节因子1、乙酰化-核因子-κB p65、核因子-κB p65、肿瘤坏死因子α蛋白表达的影响

与空白对照组比较，模型对照组大鼠中脑组织SIRT1蛋白表达降低（P＜0.01），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表达升高（P＜0.01）；
与模型对照组比较，点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组大鼠中脑组织SIRT1蛋白表达升高（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表达降低（P＜0.05）；
与点灸组比较，点灸+EX-527组大鼠中脑组织SIRT1蛋白表达降低（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和TNF-α蛋白表达升高（P＜0.05）；
与点灸+EX-527组比较，点灸+生理盐水组大鼠中脑组织SIRT1蛋白表达升高（P＜0.05），Ac-NF-κB p65、NF-κB p65和 TNF-α 蛋白表达降低（P＜0.05）。见图1、表5。

图1 各组大鼠中脑组织SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠中脑组织SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白表达比较（）

表5 各组大鼠中脑组织SIRT1、Ac-NF-κB p65、NF-κB p65、TNF-α蛋白表达比较（）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；
与模型对照组比较，#P＜0.05；
与点灸组比较，△P＜0.05；
与点灸+EX-527组比较，&P＜0.05

组别空白对照组模型对照组点灸组点灸+EX-527组点灸+生理盐水组0.46±0.06 0.92±0.11**0.59±0.07#0.75±0.09#△0.60±0.09#&8 8 8 8 8 1.10±0.11 0.49±0.07**0.84±0.10#0.67±0.07#△0.85±0.10#&0.38±0.07 0.86±0.09**0.57±0.07#0.71±0.08#△0.54±0.06#&0.46±0.06 1.15±0.13**0.65±0.09#0.86±0.10#△0.64±0.08#&TNF-α只数SIRT1Ac-NF-κB p65NF-κB p65

2.5 壮医药线点灸对模型大鼠中脑组织病理变化的影响

空白对照组大鼠中脑组织染色均匀，神经细胞排列紧密、整齐，边缘清晰，未见明显细胞肿胀、坏死等病理改变及炎症细胞浸润；
模型对照组大鼠中脑组织未见明显细胞肿胀、坏死等病理改变和炎症细胞浸润；
点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组大鼠中脑组织均未出现明显变化。总体上，各组大鼠中脑组织HE染色均未发现明显器质性病变，未见明显水肿、坏死等。见图2。

图2 各组大鼠中脑组织形态（HE染色，×400）

2.6 壮医药线点灸对模型大鼠中脑组织细胞凋亡的影响

各组大鼠中脑组织神经细胞均未见胞体缩小及胞核固缩，无明显细胞凋亡，胞核染色均匀，形态正常。见图3。

图3 各组大鼠中脑组织细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×400）

壮医药线点灸是国家级非物质文化遗产，具有祛毒通络、调气止痛等功效，且无不良反应。临床应用壮医药线点灸治疗偏头痛效果满意[22]。壮医学认为，偏头痛发病主要与外来毒邪或内生毒邪阻滞“巧坞”（大脑）之龙路、火路，致机体三道两路不畅，气血失衡，天、地、人三气不能同步运行，终致“巧坞”道路网络不通或失养相关[23]。因此，治疗以通路止痛、均衡气血，复归天、地、人三气同步运行为要。壮医将肚脐比作“命蒂”，不仅能沟通五脏六腑与先天、后天，还与人整体相通应。且脐部位于人体中央，聚集天、地、人三部之精华，可承上启下，是气血运行之枢纽，与人体天气之下降、地气之上升、人气之调和密切相关。壮医药线点灸脐环穴（3穴、6穴、9穴、12穴）不仅能畅通道路，调整机体气机，还可沟通先天与后天，鼓舞正气，祛邪外出，从而恢复机体气血均衡、三气同步的自然状态，实现镇静安神止痛。从现代医学角度分析，刺激脐环穴可能通过神经、体液而调节神经、内分泌和免疫系统，从而改善各组织器官的功能活动[19]。合谷可行气通降，开窍镇静止痛以安神；
太冲善于理气止痛，调和气血以安神。文献报道，针灸合谷、太冲可调控NF-κB信号通路，改善大脑动脉血流速度及偏头痛症状[24]。

硝酸甘油制备偏头痛模型已得到认可[25]，其在体内产生一氧化氮同时作用于血管和神经元，一方面通过强烈的扩血管作用，在血管周围产生无菌性炎症；
另一方面通过激活TGVS，激活神经源性炎症反应产生CGRP等，进一步引发偏头痛[26]。而CGRP释放入血是TGVS激活的重要环节，是引发偏头痛的重要因子[27]。本研究中，大鼠造模后出现行为学改变，与空白对照组比较，模型对照组大鼠行为学评分升高，且血清炎症因子TNF-α、NF-κB含量和舒血管神经肽CGRP含量增加，提示偏头痛模型造模成功。TNF-α、NF-κB、CGRP均参与偏头痛发生，TGVS被激活，处于炎症反应状态。干预后，点灸组、点灸+EX-527组和点灸+生理盐水组大鼠行为学评分均显著降低，血清TNF-α、NF-κB、CGRP含量减少，提示壮医药线点灸治疗可以抑制炎症因子NF-κB、TNF-α分泌，减少舒血管神经肽CGRP释放，有效调控偏头痛模型大鼠神经源性炎症反应，抑制神经血管扩张。有文献指出，TGVS存在炎症因子-CGRP-血管舒缩异常正反馈环路，进一步加强炎症反应和血管扩张，维持偏头痛持续状态[28]。由此，本研究中模型大鼠血清CGRP含量增加可能与炎症因子TNF-α含量增加相关，TGVS中炎症因子-CGRP-血管舒缩异常正反馈环路被激活，炎症因子TNF-α诱导CGRP释放，且存在恶性循环，而壮医药线点灸可以调控炎症因子-CGRP-血管舒缩异常环路，抑制炎症因子TNF-α合成与表达，从而拮抗CGRP。

miRNA是一类非编码单链RNAs，具有调控靶基因表达作用。目前已发现一些miRNAs与炎症反应[29]、慢性疼痛[30]等相关，其中miR-34a-5p与偏头痛发作相关[31]。静息状态下，NF-κB（p50、p65等亚单位）通常与其抑制因子以异源二聚体形式存在于细胞质中[32]，当机体受到炎症等信号刺激时，NF-κB被激活，快速移位进入细胞核并大量转录，促使下游炎症因子分泌[33]，从而参与炎症反应[34]。SIRT1是一种去乙酰化酶，也参与偏头痛病理过程[35]。SIRT1可直接作用于NF-κB p65，通过去乙酰化作用降低Ac-NF-κB p65水平，抑制机体炎症反应，调控下游炎症因子转录，进而改善炎症症状[36]。本研究发现，模型组大鼠中脑组织miR-34a-5p表达升高，SIRT1基因与蛋白表达降低，Ac-NF-κB p65、TNF-α蛋白及NF-κB p65基因和蛋白表达升高，提示miR-34a-5p能抑制SIRT1表达，导致SIRT1去乙酰化能力降低，NF-κB p65乙酰化，诱发NF-κB核移位，激活其介导的炎症信号通路，从而释放大量炎症因子。经壮医药线点灸干预后，miR-34a-5p表达降低，SIRT1基因和蛋白表达升高，Ac-NF-κB p65、TNF-α蛋白及NF-κB p65基因和蛋白表达降低，提示壮医药线点灸可通过抑制miR-34a-5p表达，促进SIRT1转录，提高其去乙酰化能力，抑制NF-κB激活，进而抑制下游炎症因子释放。注射SIRT1抑制剂EX-527后，出现拮抗壮医药线点灸的抗炎效应，而点灸+生理盐水组并未出现此种拮抗效果，进一步提示壮医药线点灸可通过上调SIRT1表达抑制炎症信号通路。

在本研究中模型对照组大鼠虽处于炎症状态，而中脑未出现组织形态改变和细胞凋亡，推测可能是在炎症早期，炎性细胞虽释放炎症因子，但炎症反应尚未达到引发炎性细胞浸润的程度，因而HE染色未见组织形态改变。尽管炎症会引发细胞凋亡，但与炎症因子浓度有关，并呈浓度依赖性[37]。本研究中，模型组大鼠中脑组织无明显细胞凋亡，推测低浓度的炎症因子虽引发了神经细胞功能障碍，但不足以导致神经细胞凋亡。

综上所述，壮医药线点灸脐环穴（3穴、6穴、9穴、12穴）、合谷、太冲可能通过调控miR-34a-5p/SIRT1信号通路，抑制miR-34a-5p表达，促进SIRT1转录，降低Ac-NF-κB p65水平，从而抑制NF-κB p65核转移，减少炎症因子分泌及舒血管神经肽CGRP释放，发挥治疗偏头痛作用。

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