大丽轮枝孢激活蛋白（VdAL）对马铃薯晚疫病发生的影响
时间：2023-06-14 22:25:09 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
王兴国，刘 霞，张 哲，黄 勋，邓琳梅，许改换，蒋 杰，杨艳丽*
（1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；
2.云南省植物病理重点实验室，云南 昆明 650201）
由致病疫霉［Phytophthora infestans(Mont.)de Bary］引起的马铃薯晚疫病［1］，曾在欧洲引发“爱尔兰大饥荒”，造成重大经济损失［2］。迄今为止，马铃薯晚疫病仍是一种全球范围内的毁灭性病害，我国马铃薯种植区均不同程度地受到晚疫病的危害，一般严重时减产10%~20%，特别严重时减产50%~70%，甚至绝收［3］。目前，马铃薯晚疫病仍以化学防治为主，而化学防治不仅会造成农药残留和环境污染，同时还会出现病原菌抗药性的问题［4］。因此探索晚疫病菌侵染和危害的绿色防控技术尤为重要。
植物激活蛋白是从真菌或细菌中提取获得的一种植物刺激剂，具有促进植株生长、提高作物产量、改善作物品质以及激发植物对病虫害的抗性等作用，是一种环境友好型生物农药［5］。植物激活蛋白对番茄灰霉病［6］、烟草花叶病［7］、白术根腐病［8］等植物病害均具有良好的防治效果。大丽轮枝孢激活蛋白(Verticillium dahliae Asp-f2 Like，VdAL)是源于棉花黄萎菌的一种新型植物激活蛋白，通过叶面喷施后可调节植物激素的信号传导途径，通过调节植物钙调蛋白（CaM）、脂氧合酶2（LOX2）等［9］来激活植物的免疫机制从而提升植物的抗性。VdAL也具有促进植株生长、提高作物产量、改善作物品质、诱导植物产生抗病性等作用，研究表明，VdAL在马铃薯［10］、花椰菜［11］、水稻［12］、小麦［13］、青梗菜［14］、花生［15］和葡萄［16］上均表现出良好的促生作用，可增强草莓对白粉病［5］、杨梅［17］对肉葱病的抗性。但VdAL对晚疫病菌的生物学特性是否有影响以及能否提高马铃薯植株对晚疫病的抗性等尚不明确。
鉴于此，本研究通过试验探究了VdAL对晚疫病菌生物学特性的影响，分析了经过处理后的马铃薯植株中的苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase，PAL）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）、多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）等的活性变化，以及丙二醛（Malonaldehyde，MDA）、可溶性蛋白（Soluble protein，SP）等与抗性相关物质的含量变化以及与马铃薯晚疫病发生的关系。
1.1 试验材料
1.1.1 供试马铃薯品种及菌株 供试品种为青薯9号，供试菌株为ZT10，均由云南农业大学马铃薯病害研究室提供。
1.1.2 供试培养基 黑麦番茄培养基：黑麦75 g，琼脂15 g，番茄汁100 mL，碳酸钙1.0 g，蒸馏水850 mL，pH值6.5~7.0。
1.1.3 供试药剂及试剂 10%氟噻唑吡乙酮OD（增威赢绿），由科迪华农业科技有限公司提供；
大丽轮枝孢激活蛋白（Verticillium dahliae Asp-f2 Like，VdAL），由北京中捷四方生物科技有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 孢子悬浮液的制备 待晚疫病菌在黑麦番茄培养基上生长至第10天时，用耙式牙签［18］刮取菌丝的同时使用少量无菌水冲洗培养平板，再用400目无菌网筛过滤，然后定容至10 mL；
使用血球计数板将滤液的孢子浓度调至1×104个/mL［19］，于4 ℃冰箱内释放游动孢子40 min后用于接种［20］。
1.2.2 孢子囊悬浮液的制备 待晚疫病菌长满平板表面时，用打孔器打取直径为5 mm的菌饼，分别反贴于含有浓度为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L激活蛋白的培养平板中央，以无菌水为阴性对照，0.5 mL/L浓度的10%氟噻唑吡乙酮OD为阳性对照，每个处理3皿，重复3次，于20 ℃培养箱内黑暗培养10 d，采用十字交叉法［4］测量菌落直径；
测量菌落直径后将培养平板上的菌丝全部刮取下，称量菌丝重量；
再按照1.2.1中的方法将菌丝制成孢子囊悬浮液，使用血球计数板检测孢子囊浓度。
1.2.3 孢子萌发率的测定 按1.2.2中的方法制作孢子囊悬浮液，将孢子囊悬浮液与药剂按体积比1∶1混匀，VdAL浓度分别设为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L，以无菌水为阴性对照，0.5 mL/L浓度的10%氟噻唑吡乙酮OD为阳性对照，每个处理3皿，重复3次。每个处理吸取30 μL混合液于干净的凹玻片中，于4 ℃冰箱中培养4 h后观察孢子囊的间接萌发情况，19 ℃培养24 h后观察孢子囊的直接萌发情况，每个处理重复观察100个孢子囊的萌发情况［21］。
1.2.4 盆栽试验方法
1.2.4.1 试验设计 试验于云南农业大学温室进行。选取健康发芽的种薯，种植在含有蛭石和珍珠岩（体积比为1∶1）的花盆中，每盆1株，定期进行水肥管理，保证马铃薯正常出苗和生长，在马铃薯植株出苗后第45天，将VdAL浓度分别设为5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 mg/L，10%氟噻唑吡乙酮OD浓度设为0.5 mL/L，以无菌水为空白对照，使用以上浓度对植株进行整株喷施，每株用量150 mL，再在喷施24 h后，每盆植株接种15 mL的晚疫病菌孢子囊悬浮液［19］，每个处理3盆，重复3次。分别于接种晚疫病菌后第0、1、3、5、7、9天采取植株第3~5叶位上的叶片，液氮速冻后于-80 ℃中保存，用于测定防御酶活性和抗性物质含量。通过试验可知，当VdAL浓度为20.0 mg/L时，晚疫病发病最轻。为探究VdAL对马铃薯晚疫病发生的影响机制，设置以下3个处理：20.0 mg/L VdAL处理24 h后接种晚疫病菌（T1）；
0.5 mL/L 10%氟噻唑吡乙酮OD处理24 h后接种晚疫病菌（T2）；
无菌水处理24 h后接种晚疫病菌（Q）。
1.2.4.2 病情指数和防治效果的测定 接种晚疫病菌后第10天观察植株的发病情况，病情指数参考马春晖等［22］的方法测定，病情指数和防治效果的计算公式分别为：
1.2.5 马铃薯叶片防御酶活性和抗性物质含量的测定 PAL、POD、PPO、CAT活性的测定分别采用苯丙氨酸法、愈创木酚法、儿茶酚法和钼酸铵法［23-25］；
MDA、SP含量的测定分别采用硫代巴比妥酸法和考马斯亮蓝显色法［26-27］。
1.2.6 数据分析 用Excel 2007软件和DPS 7.05软件对数据进行统计整理和分析。
2.1 不同处理对晚疫病菌的菌丝生长、孢子囊形成以及孢子囊萌发的影响
由表1~表2可知，2种药剂中仅10%氟噻唑吡乙酮OD能对病原菌生长产生显著抑制作用，含有0.5 mg/L 10%氟噻唑吡乙酮OD的培养基平板中的晚疫病菌无法生长，晚疫病菌生长至10 d时的菌落直径、菌丝重量以及孢子囊浓度均为0，表明10%氟噻唑吡乙酮OD可以有效抑制晚疫病菌菌丝的生长和孢子囊的形成，并且该处理还可有效抑制晚疫病菌孢子囊的萌发，孢子囊直接萌发率和间接萌发率均为0，与Q和T1处理达到显著差异。含有5.0~25.0 mg/L VdAL的培养平板中的晚疫病菌正常生长，与无菌水处理相比，晚疫病菌在生长至10 d时的菌落直径、菌丝重量以及孢子囊浓度无显著差异；
此外，不同浓度VdAL对晚疫病菌孢子囊的直接萌发率和间接萌发率均无影响，表明VdAL对晚疫病菌无抑制作用。
表1 不同处理对晚疫病菌菌丝生长及孢子囊浓度的影响
表2 不同处理对晚疫病菌孢子囊萌发率的影响
2.2 不同处理对马铃薯晚疫病的防治效果
由表3、图1可知，与Q相比，不同浓度的T1均可显著减轻马铃薯晚疫病的发病程度，且发病程度随着浓度的增加而逐渐减轻，但浓度高于20 mg/L后其防治效果有所降低。在经5.0~25.0 mg/L VdAL处理的植株中，其病情指数分别为47.73、42.46、41.76、38.47和40.72，可以看出20.0 mg/L是T1处理中的最佳作用浓度，其防治效果达到峰值，为39.14%，显著高于其他浓度处理。T2处理后的病情指数为18.01，较Q显著降低，其防治效果高达71.71%。虽然VdAL处理的防治效果低于10%氟噻唑吡乙酮OD处理的防治效果，但VdAL作为一种友好型生物农药也可有效地防治马铃薯晚疫病。
表3 不同处理对马铃薯晚疫病病情指数和防治效果的影响
表4 不同处理对马铃薯叶片PAL活性的影响 U/(g·min)
图1 不同处理的马铃薯植株晚疫病发生情况
2.3 不同处理对马铃薯抗病防御酶活性的影响
2.3.1 不同处理对马铃薯叶片苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响 由表4可知：喷施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和无菌水（Q）后接种晚疫病菌，马铃薯植株的PAL活性随即升高，在第5天时达到峰值，分别为175.26、162.69和148.53 U/（g·min），其中T1的PAL活性最高，较T2和Q分别提高了7.73%和18.00%；
5~9 d，3个处理的PAL活性均下降，第9天时3个处理的PAL活性非常接近。可以看出，相较于T2和Q，T1能更加有效地提升马铃薯植株的PAL活性。
2.3.2 不同处理对马铃薯叶片过氧化氢酶（CAT）活性的影响 由表5可知，喷施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和无菌水（Q）处理后接种晚疫病菌，T1的CAT活性在1~5 d内呈现稳步上升的趋势，且在接种第5天时CAT活性达到峰值，为31.94 U/(g·min)，较T2和Q分别提高了14.64%和15.77%；
第5~9天T1的CAT活性呈现逐渐降低的趋势，但仍高于同时间T2和Q的；
T2和Q的CAT活性在接种后整体上也呈现出先升高后逐渐降低的变化趋势，但变化幅度较小。上述结果说明T1提高马铃薯植株叶片CAT活性的效果最好。
2.3.3 不同处理对马铃薯叶片多酚氧化酶（PPO）活性的影响 由表6可知，喷施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和无菌水（Q）后接种晚疫病菌，马铃薯植株的PPO活性均呈现先升高后下降的变化趋势，PPO活性在0~3 d内明显升高；
第1天时，T1的PPO活性为167.48 U/(g·min)，分别比T2和Q提高了7.41%和11.27%；
第3天时，T1的PPO活性达到最大，为187.84 U/(g·min)，分别比T2和Q提高了11.96%和11.34%；
随后3个处理的PPO活性总体上逐渐降低，第5天时T1的PPO活性显著低于T2的，但在其他时间点T1的PPO活性都显著高于T2和Q的，说明T1最能有效提高马铃薯植株的PPO活性。
表5 不同处理对马铃薯叶片CAT活性的影响 U/(g·min)
表6 不同处理对马铃薯叶片PPO活性的影响 U/(g·min)
2.3.4 不同处理对马铃薯叶片过氧化物酶（POD）活性的影响 由表7可知，喷施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和无菌水（Q）后接种晚疫病菌，T1的POD活性在1~3 d内逐渐升高，第1天时，T1的POD活性为91.42 U/(g·min)，分别比T2和Q提高了17.54%和13.58%；
第3天时，T1的POD活性达到最大，为93.37 U/(g·min)，分别为T2和Q的1.10倍和1.24倍；
随后T1的POD活性逐渐降低。T2和Q的POD活性总体呈现缓慢上升后逐渐减低的变化趋势，但是变化幅度均小于T1的，说明T1最能有效提高马铃薯植株的POD活性。
表7 不同处理对马铃薯叶片POD活性的影响 U/(g·min)
2.4 不同处理对马铃薯抗病防御物质的影响
2.4.1 不同处理对马铃薯叶片丙二醛（MDA）含量的影响 由表8可知，喷施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和无菌水（Q）后接种晚疫病菌，T2的植株MDA含量在较低水平范围内上下波动，T1的MDA含量呈现缓慢增加的变化趋势，而Q的MDA含量迅速增加，且Q的MDA含量在整个处理期间均显著高于T1和T2的，接种后第1天时，Q的MDA含量迅速升高，为36.27 mmol/g，分别比T1和T2提高了25.72%、36.56%；
接种后第9天，Q的MDA 含量达到最高，为58.45 mmol/g，分别比T1和T2提高了26.98%、73.08%，说明T1和T2能有效降低马铃薯叶片中MDA的含量。
表8 不同处理对马铃薯叶片MDA含量的影响 mmol/g
2.4.2 不同处理对马铃薯植株可溶性蛋白（SP）含量的影响 由表9可知，喷施激活蛋白（T1）、10%氟噻唑吡乙酮OD（T2）和无菌水（Q）后接种晚疫病菌，T1和Q的SP含量在处理期间均呈现先升高后降低的变化趋势，而T2的SP含量变化较小且持续维持在较低水平。接种后第0~3 天，T1的SP含量明显升高，且第3天时SP含量达到最高，为12.97 μg/g，分别为T2和Q的1.21倍和1.12倍；
第3~9天T1的SP含量逐渐降低，但降幅较小，其SP含量仍高于T2和Q的，说明T1最能有效提高马铃薯植株的SP含量。
表9 不同处理对马铃薯植株SP含量的影响 μg/g
综上，大丽轮枝孢激活蛋白（VdAL）不直接作用于晚疫病菌，对晚疫病菌无抑制作用，但对马铃薯植株喷施VdAL后，第1~5天作用效果明显，显著提高了植株中的PAL、CAT、PPO、POD活性和可溶性蛋白（SP）含量，增强了植株的苯丙烷类途径代谢，提高了植株及时清除因晚疫病菌侵染而产生活性氧的能力以及醌类物质合成的能力等；
同时，VdAL处理能有效抑制植株的膜脂过氧化反应，显著降低植株的MDA含量，进而增强马铃薯植株的抗性，减轻马铃薯晚疫病发生的程度，因此，利用VdAL来激发植株的抗病性，不仅可以有效缓解晚疫病的发生程度，还可以减少化学农药的使用，在实现马铃薯晚疫病防控的同时达到保护环境的目的。
植物激活蛋白能激活作物体内的生长和防御系统，在促进生长的同时增强作物的抗病性［28］。利用VdAL防治病害的研究已有报道，如VdAL诱导草莓对白粉病的抗性，防治效果达30.33%［5］；
VdAL能显著降低杨梅肉葱病的发病率［17］。本研究发现VdAL对马铃薯晚疫病也具有良好的防治效果，其中喷施20.0 mg/L VdAL对马铃薯晚疫病的防效最好，达到39.14%，有一定的田间应用价值。
植物防御酶在植物抗病的生理反应过程中具有重要的作用，如PAL、POD、PPO、CAT等可参与木质素、植保素和总酚的合成、活性氧的清除等生理过程，从而达到增强植株抗病性的目的［29］。本研究发现喷施 20.0 mg/L VdAL后，可显著提升马铃薯植株的PAL、CAT、POD、PPO等活性，增强马铃薯植株对晚疫病的抗性，这与李丽等［6,30］使用植物激活蛋白诱导植物提升抗病性的研究结果相似。
植物体内的SP和MDA含量均是与植株抗病密切相关的生理生化指标。植物体内的SP大多是参与各种代谢的酶类，与植物抗病性密切相关［19］。MDA是膜脂过氧化的最终产物，是反映植物生物膜受损伤程度的重要指标之一［29］。本研究发现马铃薯植株经20.0 mg/L VdAL处理后，植株的SP含量显著高于10%氟噻唑吡乙酮OD处理和无菌水处理的，这可能是因为VdAL处理能有效提高植株的SP含量，具有增强植株抗病性的作用；
同时，VdAL处理还可不同程度地降低马铃薯叶片的MDA含量，这可能是因为VdAL处理能提高马铃薯植株中的POD、CAT活性，及时清除超过阈值的H2O2，减轻病原菌侵染对细胞膜的伤害，进而减少MDA的积累。
综上所述，VdAL能够有效地诱导马铃薯植株增强对晚疫病的抗性，从而减轻晚疫病的发生。但本研究尚未对其他抗病机制进行深入研究，因此关于喷施VdAL后马铃薯植株防御基因的表达、防卫信号的识别和传递、代谢通路等方面的研究将是下一步研究工作的重点。此外，VdAL在大田生产中的应用技术也需要进一步的研究。
大丽轮枝孢激活蛋白（VdAL）对马铃薯晚疫病菌的菌丝生长、菌丝重量、孢子囊形成以及孢子囊的萌发等均无影响，但VdAL对马铃薯晚疫病具有显著的诱抗效果，可通过诱导植株提高防御酶活性和可溶性蛋白含量，降低植株的MDA含量，有效地增强马铃薯植株对晚疫病的抗性，可见VdAL能够通过提高马铃薯植株的抗性来减轻晚疫病带来的危害。
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