消癌解毒方联合化疗对弥漫大B细胞淋巴瘤外周血CD4+CD25+CD127low调节性T细胞的影响
时间：2023-06-12 10:25:18 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
陈晓丽，孔祥图，于慧，姜鹏君，刘宁，倪海雯
弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）约占非霍奇金淋巴瘤（NHL）的30%～35%［1］，以R-CHOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、多柔比星、长春新碱及泼尼松）为基础的一线治疗方案极大地改善了该病的治疗现状，但是依然有约1∕3的病人面临耐药或复发［2］，对于RCHOP+X方案的探索是目前研究的热点及难点［3］。针对疗效、安全性、生活质量、治疗花费的综合考虑是优化治疗方案探索的重点，治疗后感染事件、并发症均是真实世界中DLBCL治疗管理的难题，也带来了严重的经济和心理负担［4］。中西整合治疗淋巴瘤是发挥中医药解决疑难疾病的重要举措，本团队继承及发展国医大师周仲瑛教授癌毒病机理论，结合本中心淋巴瘤诊疗实践创立消癌解毒方。在前期研究中，我们观察到消癌解毒方联合R-CHOP方案治疗初诊DLBCL，相比单纯R-CHOP方案化疗组，有助于改善中医证候，减少并发症、提高病人生活质量［5］。具体作用机制尚需进一步深入探索。有研究显示，以周仲瑛教授“癌毒”理论为指导的消癌解毒方与化学治疗药物联合使用时，能调节病人的免疫功能［6］。调节性T细胞（Treg）是一类具有免疫调节功能的T细胞，有维持机体免疫自稳的功能，对调控免疫应答方面也发挥着重要作用［7］。Treg对包括淋巴瘤在内的肿瘤生存预后的影响以及抗肿瘤免疫方面的作用，已成为肿瘤免疫治疗的研究热点［8］。淋巴瘤是一组异质性极强的肿瘤，同一病理亚型的淋巴瘤病人预后和疗效也不尽相同，目前，针对初诊DLBCL Treg的研究较少。本研究以初诊DLBCL病人为研究对象，对比消癌解毒方联合R-CDOP（利妥昔单抗联合环磷酰胺、脂质体多柔比星、长春新碱及泼尼松）方案与单纯R-CDOP方案治疗的临床疗效，及外周血Treg百分比的变化，探索Treg在初诊DLBCL病人发病中的意义以及消癌解毒方对于Treg表达的影响，揭示癌毒理论指导下的消癌解毒方对于淋巴瘤免疫调控的可能影响，为进一步形成中西结合临床新方案提供理论依据。
1.1 一般资料选取南京中医药大学附属医院2018年1月至2022年1月收治的初诊DLBCL病人共47例为研究对象，男26例，女21例，中位年龄61岁，年龄范围21～83岁。中医基本病机属正虚痰毒，瘀热互结。47例病人经病理组织活检证实为DLBCL（非特指型），符合2016年修订第4版WHO淋巴组织肿瘤分类标准［9］，且均未合并严重心脑血管、肝、肾、内分泌等其他系统性疾病。47例病人用随机数字表法随机分为治疗组（消癌解毒方联合R-CDOP方案）24例和对照组（单纯R-CDOP方案）23例。治疗组中男14例，女10例，中位年龄59岁，年龄范围25～83岁。对照组中男12例，女11例，中位年龄63岁，年龄范围21～83岁。两组病人一般资料进行比较，差异无统计学意义（P＞0.05），两组间具有可比性。见表1。本项研究中47例病人均已签署知情同意书，研究内容已经通过了南京中医药大学附属医院医学伦理委员会的批准（批号2017NL-132-02）。按随机数字表法选取健康对照组45例，男21例，女24例，中位年龄40岁，年龄范围12～80岁，均来自门诊健康体检者。
表1 初诊弥漫大B细胞淋巴瘤47例一般资料比较∕例
1.2 治疗方案所有病人给予6个疗程的R-CDOP方案化疗，6个疗程后获得完全缓解的病人，继续予2个疗程利妥昔单抗追加治疗。R-CDOP方案具体为：利妥昔单抗剂量为375 mg∕m2，第0天；
环磷酰胺750 mg∕m2，第1天；
脂质体多柔比星25 mg∕m2，第1天；
长春地辛4 mg，第1天；
泼尼松60 mg∕m2换算成等量地塞米松第1～5天。治疗可以根据病人年龄和体能评分进行调整。年龄大于80岁或体能状态较差的病人，允许采用R-miniCDOP。所有病人均在每21天进行1次化疗，化疗过程中均使用5-羟色胺3（5-HT3）受体拮抗剂托烷司琼预防化疗所致的恶心、呕吐，提高病人化疗的耐受性。治疗组的6周期化疗期间及化疗间歇期均口服消癌解毒方。消癌解毒方组成：炙鳖甲15 g、土鳖虫10 g、三棱10 g、莪术10 g、制南星10 g、浙贝母10 g、泽漆10 g、僵蚕10 g、北沙参10 g、天冬10 g、麦冬10 g、太子参15 g、拔契10 g、蛇舌草15 g、半枝莲10 g。每日一剂。煎煮方法：加入500 mL水浸泡1 h，浓煎取药汁150 mL，每次75 mL，每日两次，饭后1 h温服。
1.3 主要试剂及仪器本研究中使用的鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC（批号51）、CD25-PC5（批号200068）、CD127-PE（批号200070），红细胞裂解液（批号34）以及流式细胞仪（NAVIOS）购自美国贝克曼库尔特公司。
1.4 外周血CD4+CD25+CD127lowTreg比例检测在第1周期治疗前约1周内，及6个周期治疗结束约1月后复诊时，消癌解毒方联合R-CDOP方案的治疗组、单纯R-CDOP方案的对照组，以及健康对照组，均在各组被观察对象清晨空腹时，采取静脉血2 mL，以乙二胺四乙酸二钾（EDTA-2K）抗凝，采用直接免疫荧光标记法进行标记细胞，以流式细胞仪进行分析。本研究中，免疫表型为CD4+CD25+CD127low的细胞亚群被界定为Treg，并以CD4+CD25+CD12 7low细胞占CD4+细胞的百分比来表示Treg水平。操作步骤：各取鼠抗人单克隆抗体CD4-FITC、CD25-PC5、CD127-PE 20 μL，加入到100 μL EDTA-2K抗凝的外周血中，在室温下避光孵育15 min后，再加入红细胞裂解液500 μL，继续避光孵育10 min后，加入磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次，离心后弃上清，加入适量的PBS上机检测。
1.5 临床疗效评价标准6个周期治疗结束后，47例病人均行CT或正电子发射断层显像／计算机断层显像（PET∕CT）扫描检查进行疗效评估，参照2014版Lugano疗效评价标准中CT评价标准［10］，分为完全缓解（CR）：靶病灶（淋巴结）长径≤1.5 cm，无淋巴结外病灶，增大的器官退至正常，无新发病灶；
部分缓解（PR）：最多6个可测量靶病灶最大垂直直径乘积之和（SPD）缩小率≥50%，无新发病灶；
疾病稳定（SD）：最多6个靶病灶SPD增大率＜50%，无疾病进展（PD）证据；
PD：至少1个病灶进展即可诊断，新发病灶或原有非可测病灶明确进展，新发或复发骨髓受累。总缓解率（ORR）定义为（CR+PR）率。
1.6 统计学方法采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。计量资料采用Kolmogorov-Smirnov test进行正态性检验，本研究计量数据因不符合正态分布，采用M（P25，P75）的方式进行统计描述，以非参数检验进行各组间差异的统计学推断。各组治疗前和同组治疗前后差别的比较，均采用Mann-Whitney-U检验。采用Pearsonχ2检验进行两组疗效分布的比较。以例数对计数资料进行统计描述，组间使用χ2检验来进行统计推断。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 初诊DLBCL病人外周血Treg百分比水平治疗前，治疗组及对照组两组病人和健康对照的Treg百分比中位数（下、上四分位数）分别为6.01%（4.59%，7.82%）、5.73%（4.82%，6.58%）、7.32%（6.03%，8.71%），治疗组和对照组病人治疗前外周血百分比均低于健康人（Z=2.64、3.42，P＜0.05）。
2.2 DLBCL病人治疗前后外周血Treg百分比的比较治疗前，治疗组和对照组初诊DLBCL病人的外周血Treg细胞百分比差异无统计学意义（P＞0.05）。治疗6周期结束后，治疗组外周血Treg百分比较治疗前明显上升（P＜0.05），对照组治疗前后Treg百分比变化差异无统计学意义（P＞0.05），治疗组比对照组的Treg百分比明显上升（P＜0.05）。见表2。
表2 弥漫大B细胞淋巴瘤47例外周血Treg百分比的变化比较∕［%，M（P25，P75）］
2.3 两组DLBCL病人临床疗效比较治疗组可评价病人24例（CR16例、PR3例、SD0例、PD5例），ORR为79.17%；
对照组可评价病人23例（CR13例、PR3例、SD2例、PD5例），ORR为69.56%。两组病人疗效比较，差异无统计学意义（χ2=0.57，P=0.450）。
DLBCL是最常见的侵袭性NHL，R-CHOP方案作为一线治疗历经20年依然是初诊DLBCL病人的治疗基石。对于R-CHOP方案耐药和治疗后复发的病人治疗选择有限，优化目前治疗方案的探索依然是淋巴瘤研究领域的热点和挑战［11］。疾病相关、靶向药物治疗相关的免疫缺陷，抗肿瘤免疫的失衡在淋巴瘤的临床及基础研究中受到学者们的关注［12］，开发针对免疫调控环节的有效药物具有非常重要的实践意义。众多的具有补气、化痰、解毒功效的天然药物拥有抗肿瘤及调节免疫的双重作用［13］。课题组长期致力于探索国医大师经验方的开发应用，开展中西整合优化方案的临床和机制研究，寻找中药疗效评价新靶标。
相比于实体瘤来说，DLBCL免疫微环境调控存在更加复杂的机制，Treg是近年来抗肿瘤免疫研究的热点之一。Treg是CD4+T细胞的一个亚群，通过免疫抑制，来维持免疫系统对自身成分的耐受，从而发挥保持机体免疫稳态的作用。大多数的肿瘤免疫研究认为，Treg通过抑制机体的抗肿瘤免疫反应，在肿瘤免疫逃逸机制中发挥着重要的作用。叉头框蛋白P3（FoxP3）是Treg发挥抑制作用的主要调节因子，CD4+CD25+Foxp3+是Treg较为普遍应用的分子标记，但因Foxp3在细胞内表达，在Treg的功能研究中应用受限，多个研究表明，细胞表面蛋白分子IL-7受体（CD127）和Foxp3表达呈现密切的负相关，CD4+CD25+CD127low与CD4+CD25+Foxp3+表达高度一致，外周血CD4+CD25+CD127low可以作为Treg的分子标记［14］。因此，本研究采用流式细胞仪检测CD4+CD25+CD127lowTreg在外周血的百分比，探索Treg在初诊DLBCL中的变化，揭示其在DLBCL免疫调控中的意义。
本研究中我们检测了47例初诊的DLBCL病人和45名健康人的外周血Treg百分比，发现初诊DLBCL病人治疗前的外周血Treg百分比低于健康人，该观察结果与已报道的多种实体肿瘤病人外周血或组织中Treg表达水平偏高的情况不一致。目前在肺癌［15］、卵巢癌［16］、肝癌［17］等实体肿瘤的研究发现，病人的外周血或肿瘤组织中Treg比例较正常人增高，且高水平的外周血或肿瘤组织中Treg往往提示疾病预后不良［18］。
Treg对淋巴瘤病人生存预后的影响及其机制，目前有不同于实体瘤的研究报道。有研究发现Treg在淋巴系统肿瘤的免疫调控作用与实体瘤相比，体内Treg增多促进非血液系统肿瘤发生，相反，Treg减少促进淋巴瘤发生［19］。Dehghani等［20］研究发现Treg对肿瘤性B淋巴细胞的增殖具有抑制作用，外周血中更高比例的Treg以及Treg∕Th17（调节性T细胞∕辅助性T细胞17）比例与淋巴瘤的预后良好具有相关性，并与更好的治疗反应以及较低的复发率有关。惰性淋巴瘤中的滤泡性淋巴瘤向DLBCL的转化，也与肿瘤微环境中Treg数量的显著减少有关［21］。在DLBCL病人中，疾病恶性程度高的常见外周血Treg绝对数减低，且可作为独立于国际预后指数危险度分层的不良预后因素［22］。DLBCL病人外周血或肿瘤组织中Treg的增多或浸润，与预后良好相关［20，23］。产生这些现象的机制可能为Treg通过穿孔素∕颗粒酶调节恶性B细胞或Fas-FasL相互作用［24］，也可能是通过间接抑制B细胞成熟所必需的Th细胞来间接抑制B细胞［25］。
淋巴瘤为现代病名，目前中医药研究缺乏统一标准，“癌毒”理论是国医大师周仲瑛结合了近60年的临床经验总结而成的，在临床实践中成为指导肿瘤治疗的权威理论，并得到不断丰富和发展。程海波教授团队发展了癌毒病机学说，创立了以国医大师经验基础上的肿瘤辨治体系指南，以“消癌解毒”贯穿始终的癌毒病机理论突出了“癌毒”的特征，针对各科肿瘤的不同特点以法统方，组成消癌解毒类核心方［26］，并开展临床和基础的深入研究，揭示癌毒病机的本质及在临床研究中的意义和价值［27］。课题组在癌毒病机理论指导下结合临床实践，以病机要素“痰、热、瘀、毒、虚”为核心，组成消癌解毒方，其中，僵蚕、土鳖虫、鳖甲化痰搜剔；
制南星、浙贝母化痰解毒；
白花蛇舌草、半枝莲清热解毒。三棱、莪术活血化瘀。癌毒伤正，以气虚、阴虚为多见，故以太子参、北沙参、麦冬气阴双补。
在本研究中发现，消癌解毒方联合化疗组与对照组相比可以提高DLBCL病人外周血Treg百分比。揭示了消癌解毒方有可能通过调控Treg恢复免疫微环境的失衡、从而对于DLBCL的抗肿瘤免疫发挥积极影响。癌毒病机指导下的消癌解毒方联合化疗，具有调控肿瘤病人免疫功能的作用［28］，既往研究报道均以实体瘤较多，淋巴瘤方面鲜有报道。淋巴瘤异质性较强，化疗方案较难统一，但是初诊DLBCL目前标准一线方案仍以R-CHOP方案为主。相比于传统多柔比星，脂质体多柔比星可提高对肿瘤组织的靶向杀伤作用，减弱对心脏的不良反应［29］。因此，本研究以初诊DLBCL的病人作为研究对象，开展对照研究，采用一线R-CDOP方案联合或不联合消癌解毒方治疗，观察消癌解毒方对于Treg的影响。结果提示初诊DLBCL病人外周血Treg百分比低于健康对照，两组病人6个疗程治疗结束后，治疗组比对照组病人的外周血Treg百分比明显上升（P＜0.05）。本研究结果与近年来Treg在淋巴瘤肿瘤免疫调控的意义具有一致性。本研究中客观疗效比较，治疗组总缓解率高于对照组，但差异无统计学意义，考虑与本研究中病例数偏少、初诊DLBCL临床疗效的影响因素比较复杂，受疾病分期、分子学异质性等影响有关。另外，本研究观察时间尚短，消癌解毒方调控Treg发挥抗肿瘤免疫的影响尚不足以转化为临床客观疗效的获益。外周血Treg百分比减低是否可以用于判断DLBCL病人预后，能否成为独立于危险度分层的不良预后因素，后续须扩大样本量细化亚组分析并结合包括临床及代谢组学等多指标参数进一步在全程随访管理中观察总结、综合评估。
总之，本研究通过随机对照研究，探索了课题组临床经验方消癌解毒方对于初诊DLBCL病人外周血Treg百分比的影响、部分阐述了消癌解毒方发挥增效解毒的可能原因。目前中药复方临床应用的随机对照研究是中医药现代化研究的方向和难点。基于国医大师理论的中医临床实践指南，开展疑难疾病中西整合优化方案探索，结合客观指标阐释作用机制，开发有效方剂符合国家中医药发展的战略方向。Treg在淋巴瘤领域的相关研究揭示了其与肿瘤细胞、免疫微环境、分子靶向药应用均存在复杂的相互影响［30］，在分子靶向药治疗的时代，积极探索中医药调控Treg发挥抗肿瘤免疫的作用，同时关注中药与分子靶向药的相互作用，可形成中西结合治疗DLBCL的有效临床新方案。
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