辣椒抗PMMoV基因L4连锁标记的验证分析

朱雪梅, 郭广君, 潘宝贵, 刁卫平, 刘金兵, 高长洲, 王述彬

(1.南京农业大学园艺学院，江苏南京210095;2.江苏省农业科学院蔬菜研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室,江苏南京210014)

中国是世界上辣椒、甜椒(Capsicumspp.)种植面积最广、消费量最多的国家，常年播种面积在2.2×106hm2，约占世界辣椒播种面积的40%[1]。随着中国辣椒种植面积的扩大、种植模式多样化及气候影响，辣椒病害发生日益严重和多样。病毒病是辣椒生产上的主要病害之一，部分病毒病会严重影响果实品质，导致30%～70%的减产甚至绝收[2]。近年来烟草花叶病毒属的辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus，PMMoV)在国内大部分辣椒主产区发生，逐步成为常发性病害，在江苏地区，其检出率高达62.28%[3]。

1964年PMMoV在美国被发现[4]，随后扩散至欧洲、澳洲及亚洲等地，成为一种世界性病害。1994年中国新疆石河子地区首次报道发现PMMoV[5]，目前全国多个地区均有该病毒的报道[6]。PMMoV侵染后，辣椒叶片症状不明显，严重时出现褪绿斑驳和花叶症状，在果实上症状明显，表现为果小、果面有褪绿斑驳、凹凸斑点，甚至出现畸形与坏死现象[7]。该病毒主要为种子传毒、花粉带毒和汁液摩擦传毒，其中种子传毒和花粉带毒是远距离传播的主要途径[8]。

L基因座位于辣椒11号染色体的端粒附近，目前发现5个等位基因(L0、L1、L2、L3和L4)，其中L1～L4是辣(甜)椒抗烟草花叶病毒属病毒的主要抗性基因。根据烟草花叶病毒(TMV)在携带不同L等位基因的宿主上产生的不同症状，该病毒属病毒可划分成P0、P1、P1,2、P1,2,3、P1,2,3,45个致病基因型[9-11]。其中P1,2是目前辣椒大田和温室生产中最为常见的致病基因型，L3基因对其具有很强的抗性，通过杂交等方法将L3基因转育至商业品种中可很好地控制该致病基因型[11]。而P1,2,3致病性强于P1,2，且可克服L3的抗性，目前在中国多个省份已有发现。据报道，在枸杞辣椒(Capsicumchacoensecv.)PI260429中发现的L4等位基因对P1,2,3具有抗性[12]，并对其他致病基因型具有广谱抗性[9]。中国农业科学院蔬菜花卉研究所辣椒课题组通过回交结合分子标记辅助选择获得了携带L4抗性基因、早熟、大果型甜椒自交系 PT83-163[13]。

目前针对L4基因定位的研究已有较多报道并开发出多个与L4抗性基因紧密连锁的分子标记。2003年Matsunaga等[14]利用抗病材料AP-PM04和感病材料Mie-midori构建F2群体，鉴定出1个随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphism DNA, RAPD)标记WA31-1500。根据扩增片段长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)标记L4-c开发出的序列特异性扩增区域(Sequence characterized amplified regions，SCAR)标记L4SC340距离L4基因1.8 cM，该标记为1个显性标记[15]。通过对细菌人工染色体(Bacterial artificial chromosome，BAC)文库082F03测序开发出的共显性酶切扩增多态性序列(Cleaved amplified polymorphism sequences，CAPS)标记087H03T7距离L4基因1.5 cM[16]。Yang 等[17]在2012年鉴定出1个L4的候选基因，根据该候选基因的富含亮氨酸的重复序列(LRR)区间开发出L4segF&R标记，但是该标记与L4基因无法实现完全的共分离，说明该候选基因并不是L4基因。Lee等[18]通过分析2个BAC克隆(GenBank登录号：FJ597539、FJ597541)设计出8对引物。比较ECW(L0)、Tisana(L1)、CM334(L2)、PI159236(L3)和PI260429(L4)5个基因型用引物L-V0-4扩增出的核苷酸序列，发现L4基因型的扩增序列中存在1个34 bp的序列缺失，据此开发出1个L4-SCAR标记用于L4基因的筛选。

综上所述，目前开发出的与L4连锁的标记中，L4SC340、087H03T7及L4-SCAR3个标记具有操作方法简单、价格低廉等优点，适用于抗病材料大批量筛选。因此，本研究对上述3对标记进行验证以期筛选出准确性最高且可用于辅助筛选携带L4抗性基因种质材料的分子标记。

1.1 试验材料

供试的辣椒种质材料共103份，包括从国家蔬菜种质资源库引种的辣椒地方品种、江苏省农业科学院蔬菜研究所辣椒创新团队高代育种材料和引种自美国农业部(United States Department of Agriculture，USDA)的种质资源。鉴于一年生辣椒中基本没有携带L3和L42个抗性基因的种质材料，因此选择携带有L3基因的抗性材料C.chinensecv. PI159236和携带有L4基因的抗性材料C.chacoensecv. PI260429作为抗病对照，7份感病育种材料作为感病对照。

1.2 辣椒DNA的提取

采用简化的十六烷基三甲基溴化铵法(Hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB)提取辣椒DNA，本研究参考Loraine等[19]的方法。用1%琼脂糖凝胶和超微量分光光度计检测DNA的质量和浓度，统一调整DNA质量浓度为 50 ng/μl，保存于-20 ℃备用。

1.3 引物序列及反应程序

PCR 扩增体系总体积为 20.0 μl：DNA 模板 2.0 μl，2×TSINGKE® Master Mix 10.0 μl，上下游引物(表1)各 0.4 μl，用ddH2O 补充至 20.0 μl。

表1 3对与L4基因紧密连锁的分子标记的引物序列

引物L4SC340的PCR扩增程序为：98 ℃预变性 3 min；
98 ℃变性 20 s，50～65 ℃ (选择合适的退火温度)退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35个循环；
72 ℃延伸 7 min；
4 ℃保存。鉴于该标记为显性标记，为避免由于退火温度导致的假阳性，对其最适退火温度进行筛选，分别设置50 ℃、53 ℃、56 ℃、59 ℃、62 ℃、65 ℃ 6个退火温度。

引物087H3T7的PCR扩增程序为：98 ℃预变性 3 min；
98 ℃变性20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，35个循环；
72 ℃延伸 7 min；
4 ℃保存。

引物087H3T7的酶切扩增多态性序列(CAPS)反应体系为 10.0 μl，包括 5.0 μl PCR 产物，0.2 μlSspⅠ内 切 酶，1.0 μl Buffer，用ddH2O补足至 10.0 μl，37 ℃下孵化3 h。

用2%的琼脂糖凝胶检测L4SC340和087H3T7的PCR产物。

L4-SCAR的PCR 扩增程序为：98 ℃预变性 3 min；
98 ℃变性 20 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 40 s，30 个循环；
72 ℃延伸 7 min；
4 ℃保存。PCR 产物检测：10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(180 V, 150 min)分离 PCR 扩增产物。电泳结束后，银染法染色，观察并记录扩增结果。

2.1 辣椒育种材料田间PMMoV发病情况

2021年秋季，江苏省农业科学院六合动物科学基地的辣椒育种材料在自然条件下部分表现出被PMMoV侵染后的状况。其中7份育种材料在转色期果面表现出明显的褪绿斑驳、凹凸斑点、畸形与坏死等症状，因此选择上述7份材料作为PMMoV感病对照。

2.2 标记L4SC340引物序列最佳退火温度的确定

L4SC340为1个显性标记，为明确PCR过程中引物的最佳退火温度，避免假阳性，以携带L4基因的抗性材料PI260429和7份种质材料为试验材料，设置6个退火温度。结果(图1)显示，在50 ℃、53 ℃和56 ℃的退火温度下，8份材料全部能扩增出目的条带；
在59 ℃退火温度下，8份材料中有7份可扩增出条带；
在65 ℃的退火温度下，包括L4抗源PI260429在内的8份材料全部无法扩增出目的条带；
只有在62 ℃下，8份材料扩增差异最为明显。据此说明，62 ℃为L4SC340的最优退火温度。

2.3 L4SC340、087H3T7和L4-SCAR标记的准确性分析

以携带L3基因的PI159236和携带L4基因的PI260429 2份抗病材料和7份田间症状明显的感病材料为试验材料，验证L4SC340、L4-SCAR和087H3T73个标记的准确性。结果(图2)显示，L4SC340在携带L3和L4基因的2份材料中均可扩增出340 bp的条带，在7份感病材料中的6份中同样扩增出340 bp的目的条带(图2A)。087H3T7在携带L3和L4的抗性材料中扩增出440 bp的条带且无法被SspⅠ内切酶酶切。7份感病材料中，5份材料的PCR产物可被酶切为300 bp和140 bp，与L0基因型一致，2份材料的PCR产物则被酶切为440 bp、300 bp和140 bp(图2B)，呈现杂合状态。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测L4-SCAR标记的PCR产物，结果并不理想，无法清晰地分辨抗感材料间的差异(图2C)。针对上述问题，我们采用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，结果显示，L4-SCAR为一个显性标记，L3和L4抗性材料可扩增出102 bp、136 bp和150 bp 3条目的条带，而7份感病材料中只扩增出136 bp和150 bp 2条目的条带(图2D)。

M：DL2000 marker；
1～8：退火温度为50 ℃，其中1为抗病材料PI260429，2～8分别为感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；
9～16：退火温度为53 ℃，其中9为抗病材料PI260429，10～16分别为感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；
17～24：退火温度为56 ℃，其中17为抗病材料 PI260429，18～24分别为感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；
25～32：退火温度为59 ℃，其中25为抗病材料PI260429，26～32分别为感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；
33～40：退火温度为62 ℃，其中33为抗病材料PI260429，34～40分别为感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125；
41～48：退火温度65 ℃，其中41为抗病材料PI260429，42～48分别为感病材料CQ009、CQ011、PQ215、PQ224、PQ261、LB122、LB125。图1 标记L4SC340引物序列退火温度的优化Fig.1 Optimization of annealing temperature for primer sequence of L4SC340

M：DL2000 marker；
1:PI 159236；
2:PI 260429;3:CQ009；
4：CQ011；
5：PQ215；
6：PQ224；
7：PQ261；
8：LB122；
9：LB125。1、2对应抗病材料，3～9对应感病材料。图2 标记L4SC340(A)、087H3T7(B)和L4-SCAR(C和D)在9份抗感材料中的PCR产物Fig.2 PCR products of markers L4SC340 (A), 087H3T7 (B) and L4-SCAR (C and D) in nine resistant materials

2.4 L4SC340、L4-SCAR和087H3T7标记筛选抗PMMoV材料

利用L4SC340对93份辣椒种质材料进行筛选时发现，携带L3和L4基因的抗性材料可扩增出清晰的目的条带，但是2份感病材料同样能扩增出较为微弱的目的条带。而93份种质材料中只有7份材料未扩增出目的条带，其他材料均扩增出了目的条带(图3、表2)。

087H3T7标记在L3和L42份抗性材料中扩增出的目的条带为440 bp，在2份感病材料中扩增出的条带为440 bp、300 bp和140 bp，表现为杂合状态。93份种质材料中23份种质材料扩增后酶切条带为440 bp，与抗性材料的扩增条带大小一致；
58份种质扩增后酶切条带为3条，表现为杂合基因型；
10份种质扩增后酶切条带为2条，表现为纯合感病基因型；
此外，还有6份种质材料未扩增出目的条带，怀疑为操作误差(图4、表2)。

L4-SCAR标记在携带L3和L4基因的抗性材料中可扩增出102 bp、136 bp和150 bp的目的条带，而从2份感病材料中不能扩增出102 bp的目的条带，说明利用该标记可明显区别抗病材料和感病材料，但无法区分携带L3和L4抗性基因的种质资源。93份种质材料中14份可扩增出102 bp的目的条带，而79份材料中未扩增出102 bp的目的条带。14份抗性材料中1份为国内地方品种关口田辣椒；
其余13份则全部为从美国农业部(USDA)引种的材料且均属于C.baccatum种。携带L3抗性基因的PI159236属于C.chinense种，但是93份种质材料中的4份C.chinense种的材料中均未扩增出102 bp的目的条带(图5、表2)。

M：DL2000 marker；
1: PI 159236；
2: PI 260429; 3: CQ009；
4：CQ011；
5～97：93份辣椒种质材料。图3 标记L4SC340在97份辣椒种质材料中的扩增情况Fig.3 PCR results of marker L4SC340 in 97 pepper germplasm materials

M：DL2000 marker；
1: PI 159236；
2: PI 260429; 3: CQ009；
4：CQ011；
5～97：93份辣椒种质材料。图4 标记087H3T7在97份辣椒种质材料中的扩增情况Fig.4 PCR results of marker 087H3T7 in 97 pepper germplasm materials

M：DL2000 marker；
1: PI 159236；
2: PI 260429; 3: CQ009；
4：CQ011；
5～97：93份辣椒种质材料。图5 标记L4-SCAR在97份辣椒种质材料中的扩增情况Fig.5 PCR results of marker L4-SCAR in 97 pepper germplasm materials

表2 97份辣椒种质材料信息及基因型

L4SC340标记开发人员给出的退火温度为65 ℃[15]，但本研究中在65 ℃退火温度下，包括携带L4基因的抗性材料PI260429的8份材料中均未扩增出目的条带。退火温度设定为62 ℃时，PI260429可扩增出340 bp的目的条带，其他7份随机材料中有1份材料可扩增出目的条带。据此，后续研究中以62 ℃作为最佳退火温度。但是后续研究中，携带L3和L4基因的2份抗病材料和7份感病材料中仅有1份材料未扩增出目的条带，无法区分抗病材料和感病材料；
而93份种质材料中86份材料均能扩增出目的条带。以上结果说明标记L4SC340退火温度的稳定性不足，很容易造成假阳性，无法用于筛选携带L4抗性基因的种质材料。标记开发人员也发现该标记除了不能在携带L1等位基因的材料中扩增出目的条带外，在携带其他L等位基因(L0、L2、L3和L4)的种质材料中均可扩增出目的条带。此局限性导致该标记无法用于筛选携带L4抗性基因的种质资源，但是在L4抗性基因回交转育过程中此标记可用于抗性单株的筛选[15]。于海龙等[13]以引进材料200375(抗PMMoV,含L4基因)为抗源，以甜椒自交系 83-163为回交亲本，进行多代回交并自交，利用L4SC340分子标记辅助选择结合苗期抗病性鉴定、形态选择，选育了携带L4抗性基因、早熟、大果型甜椒自交系 PT83-163。在本研究中标记L4SC340退火温度的稳定性不足，假阳性率很高。

据报道，087H3T7为共显性标记，在所有辣椒材料中均能够扩增出大小约 440 bp 的目的片段，L4L4基因型的材料不能被SspⅠ内切酶切开，L0L0基因型的材料能够被酶切为大小约300 bp和140 bp 的2个片段，L4L0基因型的材料酶切后有440 bp、300 bp和140 bp 3条目的条带[16]。本研究中携带L3和L4基因的2份抗性材料酶切后目的片段大小均为440 bp，而7份感病材料中有5份材料的PCR产物酶切后大小为300 bp和140 bp，另外2份材料的PCR产物酶切后的大小则为440 bp、300 bp和140 bp。标记开发人员认为该标记的一大优势是可以区分L3和L4基因型材料，但是本研究中携带L3基因的PI159236和携带L4基因的PI260429的目的条带完全一致。李宁等[20]利用该标记筛选携带有L4抗性基因的种质材料时认为L4L4基因型的纯合抗病材料11 份，L4L0基因型的杂合抗病材料 1 份。但是该研究所用的抗性对照为携带L3抗性基因的PI 159236，这一结果同样证明该标记不能区分L3和L4基因型材料。本研究利用该标记筛选出与L3和L4抗病材料条带一致的种质材料23份，杂合材料62份。以上结果说明，087H3T7标记可以筛选出携带L3和L4抗性基因的种质材料，但不能区分L3和L4基因型材料，同时筛选出的杂合基因型的种质材料过多且不一定具有抗性。综上分析，用标记087H3T7筛选携带L4抗性基因的种质材料，其准确性存在很大的问题。

Kim 等[15]认为鉴于L等位基因附近的基因序列是已知的，那么通过比较携带L4基因的种质材料与携带L0基因的种质材料间的序列差异即可开发出与L4抗性基因连锁的分子标记。Lee等[18]基于此种设想，开发出1个与L4基因连锁的L4-SCAR标记。该标记为显性标记，携带L4抗性基因的材料可特异扩增出102 bp的目的条带，携带其他等位基因的种质材料无法扩增出此目的条带。本研究根据Lee等[18]的研究结果，利用2%的琼脂糖凝胶电泳检测L4-SCAR标记的PCR产物，但无法清晰地分辨抗病材料和感病材料间的差异。改用10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果显示携带L4和L3基因的抗性材料均可扩增出102 bp、136 bp和150 bp的目的条带，而7份感病材料中只扩增出136 bp和150 bp 2条目的条带。利用该标记筛选出与抗性材料具有相同目的条带的种质材料14份，且14材料均包含在087HT7标记筛选出的23份抗性种质材料中。这一结果说明该标记可以筛选出携带L3和L4抗性基因的种质材料，但是无法明确区分L3和L4基因型，同时该标记为显性标记，无法区分杂合基因型。除标记开发人员，该标记还未被其他科研人员应用及验证。本研究认为，该标记对L3和L4抗性基因筛选的准确性要高于标记L4SC340和087H3T7。

整体来说本研究检测的3个与L4连锁的分子标记均不能准确地用于筛选携带L4抗性基因的种质材料。其中标记L4SC340退火温度不稳定，很容易造成假阳性，所以其筛选结果的准确性无法保障。标记087H3T7和L4-SCAR可以筛选出携带L3和L4抗性基因的辣椒种质，但无法区分携带L3和L4基因的抗性材料，同时087H3T7存在杂合基因型过高的问题。二者比较来说，L4-SCAR筛选的准确度高于087H3T7，但是L4-SCAR为显性标记无法区分杂合基因型。因此在明确抗性材料基因型的情况下，L4-SCAR标记结合087H3T7更有利于L3和L4抗性基因转育后代抗性单株的辅助筛选。

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