陕西佛坪国家级自然保护区大熊猫主食竹叶提取物成分分析*
时间：2023-06-03 16:45:14 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
曹淯， 王乐， 代艺， 何欢柳， 袁施彬
(西华师范大学 生命科学学院，教育部西南野生动植物资源保护重点实验室，四川 南充 637009)
植物次生代谢产物(plant secondary metabolites，PSMs)是由植物初生代谢产物通过次生代谢过程产生，对食草性动物具有广泛生理效应的一类物质[1].虽然PSMs的组成和含量在很大程度上由遗传决定，但一些非生物的环境因素，如海拔、温度、光照、湿度、土壤盐分和养分等，会对植物体内PSMs的代谢造成较强的影响[2-4].海拔是对陆生植物代谢影响较大的非生物因素之一，因为随着海拔的变化，其他非生物因素几乎都会发生相应改变[5].
竹子是一种禾本科植物，被广泛用于治疗感冒、胃痛、腹泻、呕吐、胸腔感染和解毒等.研究发现，竹叶具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗微生物功能，这些功能主要与竹叶含有的黄酮苷、酚酸、香豆素和蒽醌类等PSMs有关[6-8]，且这些PSMs的组成和含量主要受竹子种类、生长环境条件、竹龄和竹器官部位的影响[9-12].
大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)为我国特有珍稀动物，其食性高度特化为以竹为主(99%以上)[13].野外大熊猫主要分布于我国秦岭、邛崃、岷山、大相岭、小相岭和凉山山系，不同山系大熊猫的分布海拔、主食竹种及喜食竹部位存在极大差异，这也就意味着不同山系的大熊猫在摄入满足自身生长、发育和繁殖所需营养物质的同时，会不同程度的摄入组成和含量不同的PSMs[14-18].
陕西佛坪国家级自然保护区(Foping National Natural Reserve,FNNR)是我国大熊猫密度最高的保护区，巴山木竹(Bashaniafargesii)是该地分布面积最广的竹种，常分布于海拔1 900 m以下，是该地大熊猫主要的食物资源[15].研究发现，从9月到次年4月，该保护区大熊猫几乎都在巴山木竹林中(冬居地)活动，巴山木竹叶在其食物组成中的比例高达98.3%[14].
本课题组对5只佩戴了GPS项圈的大熊猫在冬居地的活动位点统计分析发现，虽然每只大熊猫都有各自特定的活动位点，但是80%的活动位点都集中在海拔1 500 m以上.大熊猫在此阶段所需要的维持基础代谢、越冬、繁殖及抵抗疾病所需的物质均来自该区域的巴山木竹.由此推测，在越冬季节，分布于大熊猫活动区域和非活动区域的不同竹龄的巴山木竹叶中PSMs的成分和含量可能存在差异，优势化合物也应不同.研究为更精准地确定大熊猫活动区域和非活动区域不同竹龄的大熊猫主食竹中PSMs的差异、进一步探讨竹叶组分对大熊猫觅食策略和栖息地选择的影响以及大熊猫的保护提供理论基础.
1.1 样品采集地概况
佛坪国家级自然保护区为全国建立较早的大熊猫保护区之一，位于东经107°41′～107°56′，北纬32°32′～33°43′，总面积293 km2.保护区海拔980～2 904 m，年平均气温11.5 ℃，平均年降水量924 mm，从下到上分别为山地中温带和山地寒温带.森林覆盖率90%以上，大部分为天然次生林，植被垂直带谱分布明显.据全国第四次大熊猫调查显示，佛坪保护区的大熊猫种群密度在全国所有大熊猫保护区中最高.保护区内的竹子分布以巴山木竹与秦岭箭竹(Fargesiaqinlingensis)为主，零星间杂有金竹(Phyllostachyssulphurea)和龙头竹(Bambusavulgaris)等.巴山木竹主要分布在海拔1 900 m以下区域，为大熊猫冬、春季的主食竹类；
秦岭箭竹分布在海拔1 900 m以上的亚高山，为大熊猫夏季的主食竹类[14].
1.2 样品采集和预处理
2015年10月从海拔1 200 m开始，海拔每升高100 m设置一个采样点，共8个采样点，采集不同竹龄(1年生、2年生和多年生)的巴山木竹叶.在1 600～1 900 m的海拔梯度范围内，通过GPS发现有觅食斑块和活动痕迹的区域被确定为觅食区域/活动区域(Foraging site，FS)；
在1 200～1 500 m的海拔梯度范围内，无大熊猫活动痕迹的区域被确定为对照区域(Control site，CS).每个采样点设置3个10 m×10 m的样方，准确区分1年生、2年生和多年生竹叶，每种竹叶采集50 g(新鲜样品).所有样品采集后立即置于塑料袋中封存送实验室检测.
竹叶样品经55 ℃烘箱干燥、粉碎和过筛后，精密称取竹叶粉末(0.1±0.005)mg于1.5 mL EP管中，加入1 000 μL甲醇-乙腈-水(体积比4∶4∶2)混合溶液，涡旋60 s，于冰水浴下超声60 min，再在4 ℃下13 000 r·min-1离心15 min，取上清液，0.22 μm滤膜过滤得到竹叶提取物(bamboo leaf extract，BLE)供上机分析.
1.3 仪器、试剂及操作条件
EkspertUlraLC 110超高效液相色谱仪(美国AB Sciex公司)；
AB Triple TOF 5600高分辨质谱仪(美国AB Sciex公司)；
ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(美国Waters公司)；
乙腈、甲醇和超纯水(德国Merck公司)；
甲酸(上海安谱实验科技有限公司).
色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；
采用正负离子模式检测分析，流动相正离子模式为含0.1%(体积比)甲酸的超纯水(A)和乙腈(B)，负离子模式为含10 mmol·L-1甲酸铵的超纯水(A)和乙腈(B)，梯度洗脱条件见表1.柱温35 ℃，进样量10 μL.
表1 流动相梯度洗脱条件
质谱仪在软件Analyst TF 1.7(AB Sciex)控制下，基于IDA功能进行一级和二级质谱数据采集，一级扫范围50～1 000 m/z，二级扫范围25～1 000 m/z，一级轰击能量10 eV，二级轰击能量30 eV.ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1) 55 Pa，辅助气压55 Pa，气帘气压40 Pa，温度：550 ℃(正离子模式)，450 ℃(负离子模式)；
喷雾电压：5 500 V(正离子模式)，4 500 V(负离子模式).
1.4 数据分析
质谱数据采用MSDIAL软件进行峰寻找、峰提取和峰识别等处理，同时基于一级和二级图谱搜索MassBank、MONA、Respect和GNPS数据库，再结合HMDB、Pubchem、ChEBI和KEGG数据库进行结构鉴定和归类.最后运用Excel 2010软件和SPSS 17.0对数据进行误差方差等同性的levene检验和方差分析.
2.1 竹叶提取物成分种类划分
通过检测得到的巴山木竹叶中各化学成分的准分子离子峰精确质量和特征碎片离子信息，结合各数据库的对比，根据化学结构的不同，鉴定出陕西佛坪国家级自然保护区大熊猫活动区域1年生(FS-1)、2年生(FS-2)和多年生(FS-3)与对照区域1年生(CS-1)、2年生(CS-2)和多年生(CS-3)竹叶提取物的化合物数分别是1 235、1 234、1 166和1 074、1 047、1 022，活动区域不同竹龄竹叶提取物中的化合物数均高于对照区域；
此外，随着竹龄的增加，活动区域和对照区域BLE中化合物数均有减少的趋势.
这些化合物主要分为12超类(表2)，分别是苯丙素及聚酮类化合物(phenylpropanoids and polyketides，PPs)、脂肪及类脂分子(lipids and lipid-like molecules，LLMs)、有机杂环类化合物(organoheterocyclic compounds，OHCs)、苯环型化合物(benzenoids，BZs)、有机酸及其衍生物(organic acids and derivatives，OADs)、有机氧化合物(organic oxygen compounds，OOCs)、生物碱及其衍生物(alkaloids and derivatives，ADs)、核苷酸及类似物(nucleosides，nucleotidesand analogues,NNAs)、木脂素类及相关化合物(lignans,neolignans and related compounds，LNRCs)、有机氮化合物(organic nitrogen compounds，ONCs)、有机硫化合物(organosulfur compounds，OSCs)和碳氢衍生物(hydrocarbon derivatives，HDs).活动区域和对照区域内不同竹龄巴山木竹叶中每一超类化合物的含量具体见表2.
表2 佛坪国家级自然保护区大熊猫活动区域和对照区域不同竹龄BLE中化合物的分类、分类数及各分类数占比
对BLE中12超类物质所含的化合物分类数分析发现，前7超类即PPs、LLMs、OHCs、BZs、OADs、OOCs和ADs占其化合物总数的95%左右，平均分别达到化合物总数的23.1%、22.6%、17.8%、11.5%、9.55%、8.37%和1.98%；
除了活动区域中LLMs的化合物数量少于对照区域外，其余6超类均是活动区域化合物数量大于对照区域.
2.2 来源不同的BLE中共有成分及相对含量分析
分别对来自不同区域同一竹龄的BLE中的共有成分进行分析发现，不同区域1年生、2年生和多年生BLE中共有化合物分别为596、471种和525种；
对来自同一区域不同竹龄BLE中共有化合物进行分析发现，活动区域的不同竹龄BLE中共有化合物为512种，对照区域的不同竹龄BLE中共有化合物为323种.(图1)
(a)来源于不同区域的相同竹龄BLE中共有化合物数量 (b)来源于相同区域不同竹龄BLE中共有化合物数量
2.2.1 来源于不同区域的相同竹龄BLE中共有优势化合物超类及相对含量
将竹叶干物质中相对含量>0.10%的化合物判断为共有优势化合物.对活动区域和对照区域中共有优势化合物及其相对含量进行分析发现，FNNR大熊猫活动区域和非活动区域共有优势化合物24种(表3)，分属于PPs、LLMs、OADs、ADs和ONCs这5个超类，其中PPs类优势化合物10种，LLMs类7种，OADs类和ADs类各2种，ONCs类3种.
表3 FS和CS中共有优势化合物超类及相对含量
在这24种化合物中，FS和CS不同竹龄共有化合物仅异荭草苷和长春西汀两种，其中异荭草苷和长春西汀的含量除FS-3和CS-1中的长春西汀没有差异外，其余各组均存在显著差异(F=4.817，P=0.01 &F=5.771，P=0.000).FS中异荭草苷的平均相对含量高达11.29%，为CS的2.15倍；
FS-2中异荭草苷的相对含量为CS-2的34.86倍.FS中长春西汀的平均相对含量高达0.85%，为CS的1.23倍；
其中以FS-1中长春西汀的相对含量最高.
除异荭草苷和长春西汀外，FS和CS中1年生和2年生BLE中共有优势化合物还有3种，其中麦黄酮和十八碳烯酸含量存在显著差异(F=4.559，P=0.009 &F=4.694，P=0.001)，9-羟十八碳二烯醇含量差异不显著(F=2.812，P=0.055)；
但同竹龄BLE中这三种物质的相对含量均表现为FS高于CS，且都以FS-1中的相对含量最高.1年生和多年生BLE中共有优势化合物有牡荆素鼠李糖苷和昂丹司琼2种，各组牡荆素鼠李糖苷之间不存在显著差异(F=2.705，P=0.062)，但昂丹司琼差异显著(F=9.483，P=0.000)；
其中CS-3组昂丹司琼相对含量极显著高于其余各组.
在这24种化合物中，仅在1年生BLE中检测到的优势化合物有3种，分别是苯基丙氨酸、防己菲碱和噻苯咪唑；
其中苯基丙氨酸和噻苯咪唑在FS-1中的相对含量较高，而防己菲碱在CS-1中的相对含量较高.仅在2年生BLE中检测到的优势化合物有3种，分别是芥子酸酰胺、13-HOTrE和异雄酮，其中仅芥子酸酰胺的相对含量较高，且CS-2高于FS-2，13-HOTrE和异雄酮则表现为FS-2高于CS-2.仅在多年生BLE中检测到的优势化合物有12种，其中除3′,7-双氧葡萄糖苷木犀草素和y-亚麻酸相对含量较高外，其余10种化合物的相对含量均介于0.10%～0.62%.
2.2.2 分布于同一区域的不同竹龄竹叶BLE共有优势化合物分析
对分布于同一区域不同竹龄的巴山木竹叶中的共有优势化合物种类及相对含量分析结果见表4.分布于活动区域的不同竹龄的巴山木竹叶BLE共有优势化合物有10种，其中5种属于PPs超类，分别是麦黄酮、3′,7-双氧葡萄糖苷木犀草素、牡荆素鼠李糖苷、三叶豆紫檀苷和圣草酚.对这5超类化合物的相对含量进行比较分析发现，除FS-1和FS-3中三叶豆紫檀苷差异不显著外，其余各组各指标之间均存在极显著差异(P=0.000)，且都以FS-3中含量最高；
此外有2种属于LLMs超类，ADs超类和ONCs超类分别有1种，不同组别中这4种化合物的相对含量都存在显著差异(P=0.000)，且都以FS-1中相对含量最高.对照区域中不同竹龄的巴山木竹BLE中共有优势化合物仅有1种，为苯基丙氨酸，属于OADs超类，该化合物在不同竹龄的竹叶中的相对含量存在极显著差异(P=0.000)，以CS-3中相对含量最高，为0.3%.
表4 分布于同一区域的不同竹龄BLE共有优势化合物及其相对含量
色谱和质谱是当代分离和鉴定常用的分析技术.色谱的优势在于为混合物的分离提供最有效的选择，但难以得到物质的结构信息，需要依靠与标准品的对比来判断未知物的信息[19].质谱能够提供物质的结构信息，但其分析的样品需要进行纯化，具有一定的纯度后才能进行分析[20].研究采用UPLC-MS法在正负离子模式下扫描采集质谱数据，运用MSDIAL软件进行峰识别，结合多个数据库对色谱峰进行归属，通过不同化合物的精确分子量及特征碎片信息来鉴定未知化合物，该方法将色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的高选择性、高灵敏度及能够提供相对分子质量和结构信息的优点结合起来[21]，可以完成巴山木竹叶中PSMs成分较为全面的分析和鉴定.
分布于活动区域和对照区域的巴山木竹BLE的化合物数存在较大差异，活动区域的不同竹龄BLE的化合物数均大于对照区域.活动区域的海拔为1 600～1 900 m，而对照区域海拔为1 200～1 500 m,说明在本研究范围内，分布于高海拔地区的竹叶PSMs种类数高于低海拔. Mahzoonikachapi等在分布于1 600 m、2 400 m和3 200 m三个海拔上的薰衣草水苏(StachyslavandulifoliaVahl)中分别鉴定出47、58种和64种化合物[22]，对祁连圆柏叶中化合物的研究也发现相似的结果[23].海拔是一个综合的生态因素，海拔升高，相应的光照强度、光照量、有效积温、昼夜温差和空气湿度等生态因子相应发生改变，进而植物PSMs的组成和量发生改变[5].
无论是分布于活动区域的竹叶，还是分布于对照区域的竹叶，随着竹龄的增加BLE中化合物总数均降低，呈现出1年生>2年生>多年生的趋势.薛英等发现生长年限对植物部分初级和次级代谢物的积累与消耗均有一定程度的影响[24].相对于老龄植物，幼嫩植物代谢旺盛且营养物质含量丰富，需要更多的PSMs来进行防御活动[24].
活动区域和对照区域的巴山木竹BLE中含共有优势化合物24种，这些化合物主要分属于PPs、LLMs、OADs、ONCs和ADs五大超类.PPs超类所含的化合物种类最为丰富，以黄酮类化合物最多.王乐采用紫外分光光度计法对该研究区域内竹叶总黄酮的含量进行测定发现，竹叶总黄酮的含量有随季节和海拔变化而变化，最高可达3.17%(12月，海拔1 800 m)[7].采用HPLC-MS分析鉴定发现，在FNNR分布的巴山木竹叶中，共含有异荭草苷、麦黄酮、木犀草素、牡荆苷、三叶豆紫檀苷和圣草酚六类黄酮类化合物，其中异荭草苷为活动区域和对照区域内各竹龄的巴山木竹叶所共有，且活动区域内竹叶中的平均含量更高；
其余五种黄酮类化合物是活动区域中各竹龄BLE的优势化合物.研究发现，这些黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗微生物、抗癌和止痉挛等作用[25-31].还有研究表明佛坪大熊猫从竹类食物中摄入的黄酮类化合物越高，其肠道微生物中毒力因子的丰度越低[7].
此外，活动区域中的两种LLMs优势化合物为13-HOTrE和9-HODE，他们具有调节机体温度感受器、活化抗炎性物质和抗炎性反应等作用[25-26,32]；
从BLE中检测到长春西汀和防己菲碱两种优势生物碱[33]，其中长春西汀是活动区域和对照区域各竹龄竹叶的优势化合物，而防己菲碱仅是活动区域各竹龄竹叶的优势化合物.研究发现，经口摄入或腹腔注射长春西汀均可缓解由酒精诱导的小鼠肠道损伤[34-35]；
防己菲碱对心血管损伤引起的相关疾病具有治疗效果[36]；
有报道指出，胃肠道疾病是导致圈养大熊猫死亡最主要的原因，对野生大熊猫种群可能也是如此，大熊猫经常发生的不能解释的胃肠道疼痛可能与寄生虫或者是肠道梗阻有关[37].此次研究发现，3种ONCs(昂丹司琼，噻苯咪唑和氨甲基哌啶)为BLE中的优势化合物，但仅昂丹司琼是栖息地不同竹龄竹叶中的优势化合物.昂丹司琼是血清中5-HT3受体的竞争性抑制剂，可以延迟或促进胃排空，预防或延缓由应激或乙醇诱发的胃黏膜损伤，抑制肠梗阻中消化液的流失和炎性反应等[38].
对保护动物而言，全面了解其主要食物化学成分组成及其影响因素对动物觅食策略的影响有助于确定影响种群发展的主要因素，优化种群管理策略，实现种群的可持续性发展[14-15，18].研究发现，陕西佛坪大熊猫可食竹，包括分布于活动区域和对照区域内的，其竹叶BLE均含有具有特殊药效作用的异荭草苷和长春西汀；
相对于对照区域而言，大熊猫活动区域内的竹叶中的PSMs种类更丰富；
幼嫩竹叶中含有的PSMs的种类和量均高于老龄竹叶；
活动区域内不同竹龄的竹叶中均含有一些具有特殊生物学功能的PSMs.大熊猫以竹为生，竹类不仅要满足其生长、发育和繁殖等对营养的需求，还要满足其抵抗内源性和外源性疾病因子侵袭的需求.综合研究结果，考虑大熊猫放归地竹类食物的适宜性和海拔因素等有利于提高放归成效.分析检测圈养大熊猫投饲竹中必需养分和PSMs的成分和含量，并根据野外大熊猫的觅食策略选择适宜的投饲竹，可在一定程度上提高迁地保护成效.
