樱桃李多酚抗氧化活性及对肥胖小鼠肝脏的保护作用

张姣姣，吐克孜·吾守尔，黄伟伟，李艳红

（新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆特殊环境物种多样性应用与调控实验室，新疆师范大学生命科学学院，新疆乌鲁木齐 830054）

目前我国的超重率和肥胖率均呈不断上升趋势，已成为对我国国民健康影响最大的多因素疾病之一[1]。这正是由于机体肥胖导致机体全身慢性炎症、脂肪因子失调、糖脂毒性增加、内质网应激以及氧化应激增加等原因导致的，其中这种影响在肝脏表现尤为明显，这些因素之间的相互作用导致脂质代谢的改变和肝细胞中脂质的过度积累，且随着时间的推移并不会明显消退，致使疾病复杂化[2,3]。大量研究表明，多酚类化合物是自然产生的一类复杂的生物活性分子，具有较强的抗炎活性和抗氧化能力，能有效预防和改善高糖高脂饮食诱导的肝脏炎症和氧化应激[4-7]。多酚是植物中广泛存在的一类次生代谢产物，包括黄酮类、酚酸类、花色苷类等。不同种类植物中多酚的组成和含量不同，同种植物不同基因型多酚的组成和含量也不同，这决定了不同植物来源的多酚的功能可能不同。

樱桃李（Prunus cerasiferaEhr.）为蔷薇科李属，在我国主要分布于新疆伊犁霍城县，果实主要有紫红、黄色、紫黑色，果实营养成分丰富[8,9]，每到采摘季节，当地少数民族居民大量采集食用[10]。课题组前期研究发现，樱桃李果汁对高脂膳食诱导肥胖小鼠具有预防作用[11]。樱桃李果实中多酚含量为多少？是否对肥胖小鼠具有一定的影响？目前尚不清楚。本研究以前期醇提法获得紫果樱桃李多酚提取物为材料，在测定提取物总多酚及总多酚中黄酮、黄烷醇、酚酸含量基础上，体外分别采用DPPH、ABTS、氧自由基吸收能力法（FRAP）测定总多酚提取物的抗氧化能力；
体内以肥胖小鼠为模型，测定提取物对肝脏甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影响及对炎症相关因子表达的影响，确定樱桃李多酚提取物对肝脏保护作用，为樱桃李果实及其多酚的开发利用提供一定的基础实验依据。

1.1 材料与试剂

没食子酸、咖啡酸标准品，北京索莱宝科技有限公司；
福林-酚试剂，美国Sigma 公司；
DPPH，合肥博美生物科技有限责任公司；
芦丁标准品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
儿茶酸标准品、DMACA，上海源叶生物公司；
FRAP、ABTS、甘油三酯（TG）、总胆固醇（T-CHO）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；
无水乙醇、甲醇、甲酸、盐酸，国产分析纯；
Trizol、cDNA 反转录试剂盒、荧光定量PCR 试剂盒，天根生化科技北京有限公司。

樱桃李紫果购自新疆伊犁霍城县大西沟。果实多酚提取物由本实验室采用醇（甲醇:水:甲酸=90:9:1）提取，AB-8 大孔树脂60%乙醇洗脱，旋转蒸发仪浓缩后，冷冻干燥获得。

1.2 动物性小鼠

60 只5～6 周龄C57BL/6 雄性小鼠，购自南京君科生物公司，动物合格证号：SCXK（苏）2016-0010。

1.3 樱桃李多酚提取物中多酚含量及体外抗氧化活性的测定

1.3.1 总多酚含量的测定

参照文献方法[12]，分别以没食子酸为标准品，760 nm 测定吸光度值，得到浓度与吸光度的标准曲线。根据标准曲线算出相应的含量。

1.3.2 总多酚中成分总黄酮、总酚酸、总黄烷醇含量的测定

参照文献方法[13-16]，分别以芦丁、咖啡酸、儿茶素为标准品，410、768、640 nm 测定吸光度值，得到浓度与吸光度的标准曲线。根据标准曲线算出相应的含量。

1.3.3 DPPH 清除率测定

将1.0 mL 不同浓度（0.24、0.48、0.72、0.96、1.20 mg/mL）的样品溶液加入3.0 mL DPPH 溶液中，室温避光30 min，空白对照加1.0 mL 无水乙醇，测定517 nm 处的吸光度值，根据公式（1）计算DPPH 自由基清除率[17]。

式中：

F——DPPH 自由基清除率，%；

Ao——水+DPPH 样品的吸光值；

As——待测提取物溶液+DPPH 样品的吸光值；

Ac——待测提取物溶液+乙醇样品的吸光值。

1.3.4 FRAP 测定

按照FRAP 试剂盒说明书操作方法，测定多酚提取物抗氧化活性。以FeSO4为标准品，制作标准曲线，回归方程为：

总抗氧化能力用FeSO4标准溶液的浓度表示（单位mmol/mL）。

1.3.5 ABTS 测定

按照ABTS 试剂盒说明书操作方法，测定多酚提取物抗氧化活性。以Trolox 为标准品，制作标准曲线，回归方程为：

总抗氧化能力用Trolox 相比的倍数表示（单位mmoL/mL Trolox）。

1.4 樱桃李多酚对小鼠肝脏保护作用

1.4.1 肥胖小鼠模型的建立及实验分组与给药

60 只5～6 周龄C57BL/6 雄性小鼠，适应性喂养1 周后，随机分为2 组，一组15 只（空白对照组）喂养常规普通饲料，另一组52 只（高脂对照组）改为喂养高脂饲料，建立高脂饮食肥胖小鼠模型。8 周后，肥胖度≥20%确定建模成功。实验分为5 组：空白对照组（NC）、高脂对照组（HFD）、多酚低剂量组（HFD+L，500 mg/kg）、多酚高剂量组（HFD+H，200 mg/kg）、奥利司他组（HFD+O，15.6 mg/kg）。每组8 只。采用灌胃方式给药，每天1 次，实验进行8 周。

1.4.2 小鼠肝脏指数计算

最后一次灌胃后，小鼠禁食12 h，颈椎脱臼处死，取肝脏称其质量，根据公式（2）计算肝脏指数后，置于-80 ℃冰箱冻存。

式中：

Z——肝脏指数，%；

m——小鼠处死前质量，g；

m1——肝脏质量，g。

1.4.3 小鼠肝脏TG、T-CHO 浓度测定

将小鼠肝脏样品放无水乙醇中进行冷冻研磨，然后按照南京建成试剂盒说明书操作检测肝脏TG、T-CHO 浓度。

1.4.4 小鼠肝脏SOD 活性和MDA 浓度测定

将小鼠肝样品放在生理盐水中进行冷冻研磨，然后按照南京建成试剂盒说明书操作检测肝脏MDA 浓度和SOD 活性。

1.4.5 荧光定量PCR 检测小鼠肝脏炎症相关基因的表达

用Trizol 法提取肝脏总RNA，将RNA 反转录成cDNA。根据基因序列设计特异性引物,引物序列见表1。采用实时荧光定量PCR 法以β-actin 为内参基因，检测小鼠肝脏组织炎症因子相关基因IL-1β、TNF-α、IL-6 的表达水平。基因相对表达量计算采用2-△△Ct法。

表1 检测基因引物Table 1 Sequence of primers used in quantitative real-time PCR

1.5 统计学分析

实验数据采用SPSS 23.0 进行分析，用（x±s）表示。组间比较采用ANVOVA 分析，两组对比采用独立样本t检验。采用GraphPad Prism 8.0 软件作图。

2.1 樱桃李提取物中多酚含量及体外抗氧化活性的测定

测定樱桃李多酚提取物中总多酚含量为439.17 mg/g，提取率为68.54%，总多酚成分中黄酮类含量为186.37 mg/g，酚酸类含量为168.27 mg/g，黄烷醇含量为68.86 mg/g（表2）。说明，樱桃李醇提物中总多酚含量丰富，樱桃李多酚中黄酮类含量最高。

表2 樱桃李提取物中总多酚、总黄酮、总酚酸、总黄烷醇含量Table 2 The content of total polyphenols,total flavonoids,total phenolic acids and total flavanols in Prunus cerasifera extract

采用DPPH 法、FRAP 法、ABTS 法，测定多酚提取物体外抗氧化活性。结果发现，DPPH 自由基清除率最高可达97.42%（图1），FRAP 法、ABTS 法测得抗氧化活性分别为4.36 mmol/mL、0.48 mmol/mL Trolox（表3）。说明，樱桃李多酚提取物体外具有较强的抗氧化活性。

图1 不同浓度提取物的DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH free radical scavenging rate of extracts with different concentrations

表3 樱桃李多酚体外抗氧化活性测定结果Table 3 In vitro antioxidant activity test results of Prunus cerasifera polyphenols

沈静等[18]测定了4 种不同品种樱桃李果肉中总黄酮的含量和抗氧化活性，结果发现黄色品种中黄酮的含量最高达到2.97 mg/g，栽培品种的DPPH 自由基清除率达到95.43%。刘晓等[19]发现不同颜色的果皮多酚含量也存在明显的差异，紫黑色果皮多酚含量和抗氧化能力远高于其他颜色果皮，达到128.17 mg/g 和1 495.79 μmol Vc/g。Gunduz 等[20]发现土耳其的18 个不同品种、颜色野生樱桃李果实多酚含量存在显著性差异，总多酚最高达到583.1 mg GAE/kg Fw。与已有的研究结果比较，本研究用醇提取，60%乙醇洗脱获得提取物中多酚含量较高，且具有较强的抗氧化能力。

2.2 多酚提取物对肥胖小鼠肝脏指数的影响

小鼠解剖后，称重，计算肝脏指数。结果发现，与NC 组相比，HFD 组小鼠肝脏脏指数显著增加了1.01%（p＜0.05），出现了肝脏肿大现象。与HFD组小鼠相比，樱桃李不同剂量干预后，小鼠肝脏指数显著降低了1.11%、1.21%、0.97%（图2）。说明樱桃李多酚能够保护高脂引起的小鼠肝脏肿大。这主要是樱桃李多酚可以促进糖脂代谢，抑制脂肪在肝脏累积，进而有效抑制脂肪肝的形成。因此，樱桃李多酚对防止肝脏脂肪累积和脂肪肝的发生具有重要意义。

图2 樱桃李多酚对小鼠肝脏指数的影响Fig.2 Effect of Prunus cerasifera fruit on liver index in mice

2.3 多酚提取物对肥胖小鼠肝脏中TG、T-CHO 浓度的影响

检测肝脏中TG、T-CHO 浓度。结果发现，HFD组小鼠肝脏中TG 浓度为1.08 mmoL/L 分别显著高于NC 组0.61 mmoL/L、HFD+L 组0.91 mmoL/L、HFD+H组0.74 mmoL/L、HFD+O 组0.62 mmoL/L。HFD 组小鼠肝脏T-CHO 浓度为2.83 mmoL/L 分别高于NC 组0.67 mmoL/L、HFD+L 组1.17 mmoL/L、HFD+H 组0.99 mmoL/L、HFD+O 组0.90 mmoL/L。与HFD 组相比，多酚低、高剂量组均能显著降低高脂膳食小鼠肝脏TG、T-CHO 含量（p＜0.05）（图3、图4）。结果表明，樱桃李多酚可减少肥胖小鼠肝脏脂质沉积，防止肝脏功能异常。

图3 樱桃李多酚对小鼠肝脏TG 浓度的影响Fig.3 Effect of Prunus cerasifera fruit on TG concentration in liver of mice

图4 樱桃李多酚对小鼠肝脏T-CHO 浓度的影响Fig.4 Effect of Prunus cerasifera fruit on T-CHO concentration in liver of mice

2.4 多酚提取物对肥胖小鼠肝脏中SOD 活性和MDA 浓度的影响

检测肝脏中SOD 活性和MDA 浓度。结果发现，HFD 组小鼠肝脏SOD 活性为10.90 U/mL 分别显著低于NC 组12.47 U/mL、HFD+L 组12.16 U/mL、HFD+H组12.342 U/mL、HFD+O 组13.11 U/mL，与HFD 组相比，多酚低、高剂量组均能显著增强高脂膳食小鼠肝脏SOD 活性（p＜0.05）（图5）。HFD 组小鼠肝脏MDA 浓度为7.79 nmol/mL 分别高于NC 组3.78 nmol/mL、HFD+L 组5.85 nmol/mL、HFD+H 组4.48 nmol/mL、HFD+O 组3.98 nmol/mL。与HFD 组相比，多酚低、高剂量组均能显著降低高脂膳食小鼠肝脏MDA 浓度（p＜0.05）（图6）。表明，樱桃李多酚可通过提高小鼠肝脏SOD 活力和降低小鼠肝脏MDA 浓度提高肝脏的抗氧化能力，进而对肥胖小鼠肝脏起到一定的保护作用。

图5 樱桃李多酚对小鼠肝脏中SOD 活性的影响Fig.5 Effect of Prunus cerasifera on the SOD activity in the liver of mice

图6 樱桃李多酚对小鼠肝脏中MDA 浓度的影响Fig.6 Effect of Prunus cerasifera on the MDA concentration in the liver of mice

SOD 在维持机体的氧化-抗氧化平衡中起重要的作用，提高体内SOD 活性，有助于提高抗氧化能力[21]。MDA 作为脂质过氧化反应产生的有害物质之一，会破坏细胞膜结构，降低酶活性，减少其含量可以有效保证组织功能正常[22]。研究发现，植物多酚可以提高肝脏的抗氧化活性。李峰等[23]研究发现，与胰岛素抵抗模型相比，浒苔多酚干预能提高SOD 活性达到25.04%，降低MDA 浓度达42.92%，浒苔多酚能提高肝脏抗氧化能力。郭苗等[24]发现，酒花多酚可以改变资质过氧化酶的活性，与高血脂小鼠组相比，不同剂量的多酚干预均能显著降低MDA 浓度，增加SOD 活力，提高肝脏的抗氧化活性。本研究对肥胖小鼠肝脏内的MDA 浓度和SOD 活性进行测定，发现樱桃李多酚提取物可以提高肝脏SOD 活性，降低MDA 浓度，说明樱桃李多酚能够提高肝脏抗氧化能力，对肝脏具有保护作用。

2.4 多酚提取物抑制小鼠炎症相关基因的表达

荧光定量PCR 检测肝脏炎症相关因子IL-1β、TNF-α、IL-6 基因的表达。结果发现，樱桃李多酚对小鼠肝组织中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6 的释放有明显的抑制作用。与NC 组相比，HFD 组小鼠炎症因子的释放明显增多，IL-1β、TNF-α、IL-6 的基因表达量分别上升了1.0、2.61、3.11（p＜0.05），引起了小鼠的炎症反应。经过樱桃李多酚低高剂量和奥利司他干预后，IL-1β基因的表达量相比于HFD 组分别下降了0.33、0.94、1.07（p＜0.05）（图7），TNF-α基因的表达量相比于HFD 组分别下降了0.98、1.6、1.71（p＜0.05）（图8），IL-6 基因的表达量相比于HFD组分别下降了1.47、2.72、3.09（p＜0.05）（图9）。结果表明，樱桃李多酚能够通过下调炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6 基因的表达，对肝脏起到一定保护作用。

图7 樱桃李多酚对小鼠肝脏炎症因子IL-Iβ 表达的影响Fig.7 Effect of Prunus cerasifera on the expression of inflammatory factors IL-Iβ in the liver of mice

图8 樱桃李多酚对小鼠肝脏炎症因子TNF-α 表达的影响Fig.8 Effect of Prunus cerasifera on the expression of inflammatory factors TNF-α in the liver of mice

图9 樱桃李多酚对小鼠肝脏炎症因子IL-6 表达的影响Fig.9 Effect of Prunus cerasifera on the expression of inflammatory factors IL-6 in the liver of mice

肝脏损伤通常都伴随着炎症反应的发生。此时炎症因子释放量增多，与肝细胞膜表面的受体结合，就会引起肝脏细胞的凋亡或坏死，引起肝脏损伤。因此，控制炎症因子的释放可以减轻炎症反应进而保护肝脏免受损伤。目前，很多研究证实植物多酚具有很好的抗炎及对肝脏保护作用[25,26]。韩笑[27]通过研究发现山楂果皮多酚可以有效改善脂质异常小鼠体内的炎症反应，经过果皮多酚干预后，与模型组相比，IL-6、TNF-α基因表达量下降了14.91%、18.06%，显著抑制了炎症因子的释放。潘妍霓[28]发现，与急型肝损伤模型相比，大叶苦丁茶多酚能下调炎症因子IL-1β、TNF-α的表达，减轻四氯化碳导致的小鼠肝脏的损失。本实验测定了促炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6 在肝脏中的表达量，发现樱桃李多酚可有效降低肝脏促炎因子基因表达，表明樱桃李多酚可以通过减轻肥胖小鼠肝脏中炎症因子含量，有效保护肝脏功能。

本研究对野生紫果樱桃李中总多酚及其成分总黄酮、总酚酸、总黄烷醇含量测定，发现提取物中总多酚、总黄酮、总酚酸、总黄烷醇含量分别为439.17、186.37、168.27、68.86 mg/g。对多酚提取物体外抗氧化活性测定，发现多酚提取物体外对DPPH 自由基的清除率最高达到97.42%，FRAP 法、ABTS 法测的抗氧化能力分别为4.36、0.48 mmol/mL Trolox。结果表明，紫果樱桃李提取物中总多酚含量高，其中总黄酮和总酚酸为提取总多酚中主要成分，提取物体外具有强的抗氧化能力。同时测定了樱桃李多酚提取物体内对肥胖小鼠肝脏相关指标的影响，发现体内可降低肥胖小鼠肝脏中TG、T-CHO、MDA 浓度，提高肥胖小鼠肝脏SOD 活性，降低炎症相关因子表达，结果表明樱桃李多酚提取物对肥胖小鼠肝脏具有一定的保护作用。樱桃李多酚对肥胖小鼠具体的作用还有待于进一步深入研究。

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