超声联合微泡选择性破坏小鼠腹主动脉不稳定斑块内不成熟血管
时间：2023-01-16 13:10:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
郭胜存，张胜叶，户富栋，陈 熙，陈 魁
(郑州大学第一附属医院心血管内科，河南 郑州 450052)
斑块内新生的滋养血管通常为不成熟血管，其血管内皮不连续、基底膜不完整且缺乏周细胞，易发生渗漏[1-2]，故与斑块不稳定性显著相关，且可能成为治疗稳定和逆转易损斑块的靶点；
而易损斑块中约80%微血管结构不成熟[1]。现有抑制血管新生药物缺乏靶向性，且全身毒副作用严重[3-4]。超声介导微泡破坏所致空化效应可对不成熟血管壁直接产生局部物理损伤效应，无全身毒副作用，而对正常组织内成熟血管无显著影响[2,5]。本研究观察超声联合微泡选择性破坏小鼠腹主动脉不稳定斑块内不成熟血管的可行性及其对斑块不稳定性的影响。
1.1 实验动物及分组 于北京大学动物实验中心购入30只8周龄雄性载脂蛋白E(apolipoprotein E，ApoE)基因敲除小鼠(ApoE-/-)，体质量18～20 g，以高脂饮食(0.15%胆固醇、21%脂肪)饲养至30周龄，建立动脉不稳定斑块模型。将小鼠模型随机分为实验组(n=12)、未干预组(n=12)及对照组(n=6)。本研究经郑州大学实验动物福利伦理委员会审查并批准(批准号：2021-KY-0994-002)。
1.2 制备微泡及评价其特性 参考文献[2,6]方法制备包裹全氟丙烷脂质微泡，置于4℃冰箱中保存备用。于制备后即刻及1周后以显微镜观察微泡形态，并取20 μl微泡，以库尔特粒子计数仪检测其粒径及浓度。
1.3 超声造影 采用Siemens Sequoia 512超声诊断仪，15L7探头，频率7 MHz。将探头固定于腹主动脉长轴，采集常规超声图像。对实验组及未干预组经鼠尾静脉弹丸式注入0.1 ml微泡，以机械指数为0.18的造影对比脉冲序列模式行超声造影，保存图像至显影图像廓清，评估微泡在体内的显影时间[7]；
并于造影后处死未干预组小鼠。
1.4 超声治疗 以脉冲式超声空化治疗仪(DCT-700，深圳市威尔德医疗电子有限公司)对实验组及对照组行超声治疗。实验组于经尾静脉弹丸式注入0.1 ml微泡 8～10 s后以超声辐照腹主动脉斑块对应体表区域[2]，能量3.0 MPa，探头频率1.0 MHz，超声发射占空比0.19%，间歇辐照模式(探头发射工作2 s后间歇8 s)，脉冲重复频率10 Hz，治疗时间1 min；
治疗后24 h随机处死6只，余6只饲以高脂饮食至后8周处死。对照组小鼠及接受相同方式超声治疗及高脂饮食饲养，8周后被处死。
1.5 病理检查 分离并取出腹主动脉组织，行HE、Masson染色，观察脂质沉积和胶原纤维，以Image J软件面积法分别测量其含量[7]；
分别以CD68和α-SMA标记巨噬细胞和平滑肌细胞，以免疫组织化学法评价其在斑块中的含量，以斑块内见棕黄色或黄褐色区域为其表达阳性，并采用Image-Pro Plus软件进行半定量分析，以测量目标的面积与斑块总面积的比值代表其相对含量，并根据公式1、2计算斑块易损指数及核/帽比值[7]：
(1)
(2)
以CD31标记内皮细胞，以免疫组织化学法检测斑块内微血管，斑块内见棕黄色血管内皮细胞或细胞簇代表1条单独的微血管；
以CD31和α-SMA共同标记内皮细胞和周细胞，以荧光染料DAPI标记细胞核，采用免疫荧光染色法检测斑块内不成熟血管，将1个CD31阳性内皮细胞周围缺乏α-SMA阳性周细胞定义为1条不成熟血管或新生血管。于100倍光镜下观察标本，选择3个血管着色最丰富区域；
转换400倍光镜观察视野中的微血管数，取3个视野的平均值，评估斑块微血管密度(micro-vessel density, MVD)[8]；
以Image-Pro Plus软件对所取视野免疫荧光图片进行合并通道(Merge)，评价斑块内不成熟血管MVD，并计算成熟血管的MVD。对心、肝、肾及肺组织行HE染色，评估微泡安全性。
1.6 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件。对计量资料以Shapiro-Wilk检验行正态性检验，以±s表示符合正态分布者，2组间比较采用独立样本t检验。以Pearson相关分析评估两变量之间的相关性。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 微泡特性 新鲜制备微泡的浓度为8.62×108个/ml，粒径0.88～3.44 μm，平均(2.16±1.28)μm；
约99.1%的微泡直径<7 μm(图1A)，光学显微镜下微泡形态完整、规则、细密、分布较均匀(图1B)。置于4℃冰箱贮存1周后，微泡浓度、粒径及形态均无明显改变(图1C、1D)。
二维超声见小鼠腹主动脉内膜不同程度局限性增厚(图2A)，CDFI示局部血流丰富(图2B)，即斑块形成；
超声造影见斑块局部增强(图2C)。注入微泡后约9 s，未干预组腹主动脉显影达峰(图3A)，峰值减半时间为5.78～10.63 min，中位峰值减半时间为8.08 min(图3B)，廓清时间为15.34～20.49 min，中位廓清时间为17.92 min(图3C)。
2.2 斑块MVD与斑块易损性 CD31染色显示未干预组腹主动脉斑块内含丰富微血管(图4A、4B)；
HE和Masson染色显示斑块内存在大量脂质沉积(图4C)和少量胶原纤维(图4D)；
CD68和α-SMA染色显示斑块内表达大量巨噬细胞(图4E)和少量平滑肌细胞(图4F)。腹主动脉斑块MVD为43～144条/视野，平均(88.25±30.5)条/视野，易损指数为0.75～2.97、平均1.83±0.76，核/帽比值为0.714～2.468、平均1.60±0.58；
MVD与易损指数及核/帽比值均呈正相关(r=0.728、0.739，P均<0.05)，见图5。
2.3 斑块内不成熟血管MVD与斑块易损性 未干预组腹主动脉斑块CD31和α-SMA双标记免疫荧光染色(图6)显示，斑块内不成熟血管的平均MVD为(78.25±15.84)条/视野，成熟血管平均MVD为(15.67±4.56)条/视野。未干预组腹主动脉斑块内不成熟血管MVD与斑块易损指数及核/帽比值均呈正相关(r=0.732、0.680，P均<0.05)，而其内成熟血管MVD与斑块易损指数及核/帽比值无明显相关(P均>0.05)，见图7。
2.4 超声联合微泡选择性破坏斑块内不成熟微血管 实验组超声联合微泡治疗后24 h，斑块内不成熟血管MVD相比未干预组减少(P<0.05)，2组间成熟血管MVD差异无统计学意义(P>0.05)，见图8；
治疗后8周，与对照组相比，实验组斑块内平滑肌细胞含量显著增加，巨噬细胞含量和MVD均减少(t=-9.82、5.78、9.12，P均<0.05)，斑块易损指数及核/帽比值降低(t=11.81、6.33，P均<0.05)。见图9、10。
各组小鼠心、肝、肾及肺组织均未见出血、梗死及炎症浸润等异常表现。
本研究制备的脂质微泡性状稳定，用于小鼠实验的微泡均为新鲜制备；
库尔特粒径分布图结果显示微泡平均粒径约2.16 μm，约99%的微泡直径<7 μm，其中可能含有部分纳米级微泡，经静脉注射进入体内后可顺利通过肺部毛细血管网而进入全身循环系统，并通过易损斑块的新生滋养血管进入动脉斑块内；
实验过程中无小鼠死亡，且其心、肝、肾、肺组织内未见出血、梗死及炎症浸润等表现，与既往报道[2]相符，提示所用微泡制备方法安全、可行。
超声介导微泡破坏可引起空化效应，超声声压是决定惯性空化的重要参数之一[2]。微泡介导的超声空化强度与血管损伤呈正相关[9]。超声联合微泡治疗后，不成熟血管的密度随超声波增加而逐渐减少，超声能量增大至3.0 MPa时，新生血管大部分被破坏，而对于正常组织无显著影响[2,5,10]。本研究以超声能量3.0 MPa的超声联合微泡进行治疗，治疗后24 h，相比与未干预组，实验组腹主动脉斑块不成熟血管MVD减少，而正常成熟血管MVD无明显差异。分析原因，主要在于大部分斑块中的MVD为未成熟血管，其结构异常，内皮间隙增大，基底膜存在缺陷，周细胞覆盖率低[1,11-12]，使其对超声联合微泡的空化效应高度敏感，而成熟血管则相对不敏感[13]。
本研究结果显示，超声联合微泡治疗后8周，相比对照组，实验组腹主动脉斑块巨噬细胞含量减少、平滑肌细胞含量升高、易损指数和核/帽比值降低，提示超声联合微泡可选择性有效破坏斑块内不成熟血管、提高斑块稳定性。单次超声联合微泡治疗后，残留的斑块内新生血管仍可导致红细胞外渗，可能是导致斑块不稳定的因素之一[11,14]。超声联合微泡多次治疗破坏动脉斑块血管生成效果尚待进一步观察。
本研究的局限性：①动物实验研究，且样本量小；
②所用微泡为非靶向微泡，以靶向新生血管的微泡可能更易实现精准治疗，有待后续观察。
综上，超声联合微泡可选择性破坏小鼠腹主动不稳定斑块内不成熟血管，改善斑块不稳定性。
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