基于网络药理学和分子对接探讨中药赤芍抗胃癌的作用机制

许颖，付纪源，王雨情，吴健，刘冰，陈宁，于蕾，刘颖杰，李文兰※

（1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150076；
2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，黑龙江 哈尔滨 150076）

胃癌是世界上第四大常见癌症和第二大常见癌症死亡原因，在东亚、东欧和中南美洲部分地区，胃癌的发病率特别高[1]。在中国，每年新诊断出来的胃癌患者逐年递增，对公共健康已经构成了严重的威胁[2]。胃癌是由多种病因导致的一种疾病，发病机制非常复杂，研发新的肿瘤治疗技术和方法迫在眉睫。中药在治疗恶性肿瘤上具有治疗效果好、副作用小等优势，所以开发具有治疗恶性肿瘤作用的中药是非常有必要的。

赤芍（Radix paeoniae Rubra）为毛茛科（Ranunculaceae）植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）或川赤芍（Paeonia veitchii Lynch）的干燥根[3]。《神农本草经》列芍药为中品[4]，《神农本草经》记载芍药的功效为“味苦平主邪气腹痛，除血痹，破坚积，寒热，疝瘕，止痛，利小便，益气”[5]。在现代临床医学中，赤芍在治疗肿瘤方面也有显著效果[6-10]。其中在治疗胃癌方面，Wang等[11]发现赤芍中的活性成分可通过抑制胃癌相关成纤维细胞的侵袭和迁移能力，从而阻止成纤维细胞激活胃癌细胞的相关信号通路，达到抗肿瘤的目的。由此可见，中药赤芍作为抗胃癌药物具有良好的应用前景。目前，对于中药赤芍抗胃癌的活性成分及其作用机制的研究尚不完整。本研究运用网络药理学和分子对接技术，通过挖掘主要靶点及相关通路，构建中药赤芍的活性成分与胃癌疾病靶点的相互作用网络，阐明赤芍抗胃癌潜在的作用机制，从而为研究中药赤芍的抗肿瘤药效物质基础和作用机制奠定基础。

1.1 数据库、软件及在线网站

中药系统药理学分析数据库TCMSP（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php/）；
String数据库（https://stringdb.org/）；
UniProt数据库（http://www.rcsb.org/）；
Pub-Chem数 据 库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）；
OMIM（http://www.omim.org/）；
PharmMapper数据库（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）；
GeneCard数据库（https://www.genecards.org/）；
DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）；
PDB数据库(http://www.rcsb.org/)；
Cytoscape 3.7.2软件；
AutoDockTools 1.5.6软件；
Python 2.5.0软件；
PyMOL 2.3.0软件；
OpenBabel 3.1.1软件；
微生信在线网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）。

1.2 赤芍活性成分及其靶点的筛选

通过检索TCMSP[12]数据库，以口服生物利用度OB≥30%、类药性DL≥0.18为筛选依据，获得赤芍的活性成分及相应靶点，并通过查阅相关文献对其进行补充来筛选赤芍活性化合物，在PubChem数据库中下载对应活性化合物的SDF文件，导入PharmMapper[13]数据库中，选取标准拟合分数在0.98以上的靶点，对赤芍活性成分的靶点进行补充，并利用Uniport[14]数据库在限定基因来源为“homo sapiens”的前提下将预测的靶点名称转化为基因名。

1.3 胃癌疾病靶点的筛选

通过在OMIM和GeneCard[15]数据库中以“stomach cancer”和“gastric carcinoma”作为关键词，对相关靶点进行检索，去重后得到胃癌疾病靶点。其中在通过GeneCard数据库收集靶点时，对检索出的靶点评分取两次中位数，选取大于两次中位数评分的靶点作为胃癌疾病靶点。取赤芍成分靶点与疾病靶点的交集靶点，作为中药赤芍抗胃癌的作用靶点。将赤芍成分和作用靶点共同导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建赤芍成分作用靶点网络。

1.4 蛋白 蛋白相互作用（PPI）的构建

将交集靶点导入String[16]数据库，物种选择“homo sapiens”进行PPI网络分析，下载“TSV”格式并导入到Cytoscape 3.7.2软件中分析网络，计算degree值的中位数，将degree值大于2倍中位数的靶点作为核心靶点。

1.5 GO及KEGG富集分析

将交集靶点导入DAVID[17]数据库中，物种选择“homo sapiens”进行GO富集（生物学过程：BP、细胞组分：CC和分子功能：MF）和KEGG通路分析，通过微生信在线工具网（http://www.bioinformatics.com.cn/）对结果进行可视化处理。将关键成分、交集靶点和通路共同导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建赤芍关键成分作用靶点 通路网络。

1.6 分子对接

根据1.3项下利用Cytoscape 3.7.2软件分析得到成分 作用靶点网络，选取degree值大于中位数的成分作为对接配体，通过在TCMSP数据库检索下载“Mol2”格式文件。

将1.4项下筛选出的核心靶点，选取degree值前5的靶点作为分子对接的靶点蛋白，在PDB[18]数据库中下载对接蛋白的3D结构，以“pdb”格式保存，导入至PyMOL 2.3.0软件对蛋白进行除水、除配体，再将其导入至AutoDock Tools 1.5.6软件对蛋白进行加氢、计算电荷和设置原子类型，筛选的配体在Ligand项下进行“Detect Root”、“Choose Torsions”操作，经过前处理的蛋白和配体在“Grid”项下设置对接范围后开始进行对接，通过OpenBabel 3.1.1软件将导出文件由“pdb”格式转换为“pdbqt”格式，结果用PyMOL 2.3.0软件进行可视化处理。

2.1 赤芍活性成分及靶点的筛选

利用检索TCMSP数据库，以OB（%）≥30，DL≥0.18进行筛选，确定了23个赤芍活性成分，并结合文献检索，得到8个具有明确抗肿瘤活性的成分，分别为Progallin A[19]、paeonol[20]、salicylic acid[21]、Methylgallate[22]、Sitogluside[23]、3,4,5-trihydroxybenzoic acid[24]、peonidin[25]和Oxypaeoniflorin[26]，最终共筛选到31个化合物，见表1。通过TCMSP数据库和PharmMapper数据库检索，经去重共检索出212个赤芍活性成分相关靶点。

表1 中药赤芍活性成分Table 1 Active components ofRubra

类药性指数DL MOL001907 Progallin A 25.61 0.06 MOL000874 paeonol 28.79 0.04 MOL001801 salicylic acid 32.13 0.03 MOL001906 Methylgallate 30.91 0.05 MOL000357 Sitogluside 20.63 0.62 MOL000513 3,4,5-trihydroxybenzoic acid 31.69 0.04 MOL006765 peonidin 26.92 0.27 MOL007008 4-ethyl-paeoniflorin_qt 56.87 0.44 MOL005089 Oxypaeoniflorin 8.38 0.78 MOL001002 ellagic acid 43.06 0.43 MOL001918 paeoniforgenone 87.59 0.37 MOL001924 paeoniflorin 53.87 0.79 MOL001925 Paeoniflorin_qt 68.18 0.40 MOL002714 baicalein 33.52 0.21 MOL002776 Baicalin 40.12 0.75 MOL000358 beta-sitosterol 36.91 0.75 MOL000359 sitosterol 36.91 0.75 MOL004355 Spinasterol 42.98 0.76 MOL000449 Stigmasterol 43.83 0.76 MOL000492 (+)-catechin 54.83 0.24 MOL006992 (2R,3R)-4-methoxyl-distylin 59.98 0.30 MOL006999 Stigmast-7-en-3-ol 37.42 0.75 MOL007003 benzoyl paeoniflorin 31.14 0.54 MOL007004 Albiflorin 30.25 0.77 MOL007005 Albiflorin_qt 48.70 0.33 MOL007012 4-o-methyl-paeoniflorin_qt 56.70 0.43 MOL007014 8-debenzoylpaeonidanin 31.74 0.45 MOL007016 Paeoniflorigenone 65.33 0.37 MOL002883 Ethyl oleate(NF) 32.40 0.19 MOL005043 campest-5-en-3beta-ol 37.58 0.71 MOL001921 Lactiflorin 49.12 0.80标识Mol ID分子名称Molecule Name口服生物利用度（%）OB

2.2 赤芍成分 靶点网络的构建

将筛选出的活性成分与成分靶点导入Cytoscape 3.7.2软件中，分析得到成分 作用靶点网络，如图1所示。该网络共有533条边和242个节点，其中椭圆形节点表示为赤芍活性成分，长方形节点表示成分靶点，节点颜色越深、形状越大表示其degree值越高。由拓扑参数可得赤芍活性成分degree值的中位数为14，degree值大于14的成分有baicalein、beta-sitosterol、Stigmasterol、salicylic acid、paeonol、ellagic acid、Spinasterol、(+)-catechin、paeoniflorin、(2R,3R)-4-methoxyldistylin、Sitogluside、paeoniflorgenone、3,4,5-trihydroxybenzoic acid、Methylgallate和Progallin A。由此可见，中药赤芍是通过多成分、多靶点相互作用来发挥作用的。

2.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）的构建及分析

通过检索OMIM和GeneCard数据库，经去重共获得2 270个胃癌相关疾病靶点，其中与赤芍成分的共同靶点有102个，将102个交集靶点导入String数据库，所得到的蛋白 蛋白相互作用（PPI）网络中，共有1 606条边和108个节点。结果利用Cytoscape 3.7.2软件分析，度值中位数为26，以度值大于52为筛选条件，得到17个核心靶点，核心靶点及拓扑参数见表2。这些靶点之间的联系更为紧密，推测这些靶点可能在赤芍治疗胃癌疾病中发挥着关键作用。

表2 核心靶点及拓扑参数Table 2 Core targets and topological parameters

2.4 GO及KEGG富集分析

将交集靶点通过DAVID数据库进行GO富集和KEGG通路分析。在GO富集分析结果中，共有230条生物过程条目（FDR＜0.05），其中包含167条BP（主要为对药物的反应、凋亡过程的负调控和细胞增殖的正调控等），25条CC（主要为细胞外间隙、胞质、胞外区和膜筏等），38条MF（主要为酶结合、蛋白结合和转录因子结合等），如图2所示。在KEGG通路富集分析结果中，共分析得到了115条通路（FDR＜0.05），取排名前20的通路，如图3所示。通路主要富集在癌症通路，有45个靶点与其有密切联系、31个靶点参与乙型肝炎通路、21个靶点参与美洲锥虫病通路、21个靶点富集在TNF信号通路以及24个靶点参与甲型流感等。将筛选出的关键成分、潜在靶点及信号通路导入Cytoscape 3.7.2软件中，分析得到关键成分 作用靶点 通路网络，如图4所示。其中圆形节点代表交集靶点，六边形代表关键活性成分，“V”字形节点代表通路。

图2 赤芍抗胃癌靶点GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of anti-gastric cancer target ofRubra

图3 赤芍抗胃癌的KEGG分析气泡图Fig.3 Bubble diagram of KEGG pathway analysis of traditional Chinese medicineRubra against gastric cancer

图4 赤芍成分-靶点-通路相互作用网络Fig.4 Compounds-targets-pathways network ofRubra

2.5 分子对接

选择赤芍成分 作用靶点中degree值大于中位数的成分与核心靶点排名前五的靶点ALB、AKT1、IL6、TP53和VEGFA通过AutoDock Tools 1.5.6软件分别进行对接并打分，见表3。结果显示，分子对接得分均小于0，说明对接的化合物与靶点都可以自发的结合。从表中可知，与排名前5的靶点对接，结合能小于﹣25.08 kJ mol-1的化合物有7个，分别为化合物paeoniflorgenone、(+)-catechin、Stigmasterol、salicylic acid、paeonol、Spinasterol和化合物beta-sitosterol。其中化合物Stigmasterol与TP53蛋白结合能力最强，分数为﹣8.27，化合物Stigmasterol与TP53蛋白结合时，可与TP53A氨基酸残基PRO151形成氢键，与LEU201、ARG202、PRO219、TYR220及GLU221氨基酸残基形成7个疏水键。如图5所示，蓝色部分为化合物Stigmasterol。

图5 化合物Stigmasterol与TP53分子对接图Fig.5 molecular docking diagram of compound Stigmasterol and TP53

表3 中药赤芍成分与靶点分子对接结合情况Table 3 Docking and binding ofRubra components and target molecules

表3 中药赤芍成分与靶点分子对接结合情况Table 3 Docking and binding ofRubra components and target molecules

成分 Ingredient 结合能（kJ mol-1） Binding energy AKT1 ALB IL6 TP53 VEGFA ellagic acid -24.06 -17.82 -23.47 -23.43 -23.39 paeoniflorgenone -25.27 -20.88 -20.75 -26.48 -24.85 Paeoniflorin -14.27 -6.65 -15.06 -20.13 -16.57 baicalein -4.10 -4.48 -3.89 -5.31 -3.93 beta-sitosterol -27.07 -19.33 -23.47 -29.54 -28.58 Spinasterol -24.77 -21.59 -27.57 -29.37 -28.41 Stigmasterol -28.33 -17.99 -25.48 -34.60 -32.26(+)-catechin -28.91 -18.07 -21.71 -24.39 -24.39(2R,3R)-4-methoxyl-distylin -20.67 -13.56 -210.76 -20.33 -19.87 3,4,5-trihydroxybenzoic acid -16.82 -14.64 -18.62 -22.84 -17.91 salicylic acid -20.17 -16.44 -17.66 -27.32 -19.12 paeonol -18.38 -18.53 -23.05 -29.21 -23.43 Sitogluside Methylgallate Progallin A-19.44 -13.04 -14.92 -20.31 -18.53-19.73 -18.91 -21.85 -26.23 -20.74-22.91 -13.04 -20.98 -24.54 -22.71

在中医学中对胃癌症候有着系统的阐述，根据胃癌在临床上的表现，可将中医理论中的“胃脘痛”、“噎膈”、“反胃”、“伏梁”、“心腹痞”、“积聚”、“食痹”和“癥瘕”归属为胃癌的范畴[27,28]。本研究采用网络药理学方法预测赤芍活性成分及抗胃癌作用靶点，共筛选出31个活性成分及102个成分和疾病交集靶点、15个关键活性成分以及17个核心靶点，通过分子对接技术对赤芍关键活性成分和筛选得到度值排名前5的靶点进行结合力打分，对接结果均显示出一定结合活性，以此来探究中药赤芍有效成分抗胃癌的作用机制，为下一步赤芍抗胃癌药效物质基础研究提供依据。

通过赤芍成分-疾病靶点网络发现，baicalein、beta-sitosterol、Stigmasterol、salicylic acid、paeonol、ellagic acid、Spinasterol、(+)-catechin、paeoniflorin、(2R,3R)-4-methoxyl-distylin、Sitogluside、paeoniflorgenone、3,4,5-trihydroxybenzoic acid、Methylgallate及Progallin A成分在中药赤芍抗胃癌疾病中可能发挥着关键作用。其中度值最高的化合物为baicalein，与之所对应的靶点有45个，有研究表明，baicalein可通过调控p12-LOX、VEGF等相关蛋白的表达来抑制胃癌细胞的增殖和迁移[29]，通过下调TGF-/smad4信号通路和P38信号通路抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力[30,31]，还可诱导胃癌细胞凋亡，下调B淋巴细胞瘤的表达[32]以及抑制胃癌细胞糖代谢来抑制和干预胃癌的发展[33]，但其分子对接模拟过程中结合活性较低，可能与实际情况存在差异。(+)-catechi n为黄酮类化合物，杜培培[34]发现，(+)-catechin可以通过抑制ASICs的表达来抑制胃癌细胞的侵袭和迁移。研究发现，paeonol对胃癌细胞有明显的增殖抑制作用[35]，还能通过调节Bax和Bcl-2相关蛋白诱导胃癌细胞的凋亡，抑制胃癌细胞的侵袭和迁移能力，其机制可能与下调MMP-2/MMP-9有关[36]。beta-sitosterol、Stigmasterol、Spinasterol和Sitogluside为甾醇类成分，分子对接模拟实验中与蛋白结合前3个化合物表现出了良好的结合活性，甾醇可抑制NF-B p65和Bcl-2蛋白的表达、促进Bax蛋白的表达以及Caspase-3的活化来抑制胃癌细胞的增长并诱导其凋亡[37]，其中beta-sitosterol可通过介导AMPK、PTEN和Hsp90抑制胃癌细胞生长[38]，PI3K/AKT/m TOR通路诱导细胞自噬[39]。Stigmasterol能诱导G2/M细胞周期停滞，抑制癌细胞迁移，还能抑制JAK/STAT信号通路[40]、Akt/mTOR通路[41]诱导肿瘤细胞凋亡和保护性自噬。根据蛋白 蛋白相互作用（PPI）网络可得，ALB、AKT1、TP53、IL6、VEGFA、JUN、MAPK1、EGFR、TNF、MMP9、MAPK8、CASP3、PTGS2、FOS、ESR1、MAPK14及PETN可能是赤芍治疗胃癌疾病的核心靶点。ALB是人体血清总蛋白中的主要蛋白质成分，参与炎症反应发生、发展及转归的各个阶段[42]。AKT1可参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程，有研究表明，AKT1在胃癌组织中高表达，AKT1参与胃癌的发生、发展及浸润转移等生物学行为[43]，通过抑制AKT1的表达，可抑制胃癌细胞迁移及侵袭[44]。TP53可以诱导细胞衰老、凋亡、周期阻滞、DNA修复或代谢改变[45]。IL-6作为抗炎性肌细胞因子和促炎细胞因子在炎症和B细胞成熟、促进T细胞的增殖以及促进或抑制肿瘤细胞的增长中起重要作用[46,47]。VEGFA作用于内皮细胞可诱导血管生成，介导增加的血管通透性以及促进细胞迁移和抑制细胞凋亡，研究发现通过靶向调控VEGFA可抑制胃癌血管新生[48]，抑制VEGFA的表达来抑制胃癌细胞增殖、侵袭和迁移[49]，推测这些核心靶点与靶点相互作用，共同发挥着抗胃癌的作用。

通过GO富集和KEGG通路分析发现，赤芍治疗胃癌的抗癌途径主要通过参与凋亡过程的负调控、药物反应等生物过程以及调控癌症TNF、HIF-1等信号通路来完成的。在体内肿瘤坏死因子（TNF）可介导多个细胞反应[50]，TNF的失调可引起包括癌症疾病在内的多种疾病的发生[51-54]。有研究报道，TNF中TNF-亚基对胃癌细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭均有影响，可促进胃癌的发生[55]。TNF与胞外的TNF-R1结合形成的复合体还可激活RIP和TRAF2，并分别激活NIK和MKK，从而激活NF-B信号通路以及JNK信号通路来影响靶基因的转录。而HIF-1信号通路中HIF-1是由HIF-1与HIF-1两个亚基组成的[56]。HIF-1的蛋白稳定性和转录活性的程度则主要受细胞内氧浓度高低的影响[57]，对于肿瘤细胞来说，它是调节肿瘤细胞适应缺氧微环境的关键转录激活因子[58]。有研究表明，HIF-1可能通过抑制APC表达，使-catenin累积，促进EMT的发生，从而促进胃癌的转移，因此抑制HIF-1的活性可能是防止胃癌浸润、转移的治疗新手段[58]。除此之外，P值排名不在前20的PI3K-AKT[59,60]通路、MAPK通路[61]和P53等信号通路在抗胃癌方面也发挥着重要作用。由此推测赤芍可能是通过诱导胃癌细胞凋亡、提高机体免疫力以及防止胃癌细胞浸润和转移来达到治疗目的的。

通过分子对接技术验证可知，赤芍中ellagic acid、paeoniflorgenone、beta-sitosterol和Stigmasterol等成分可以与ALB、AKT1、IL-6、TP53和VEGFA蛋白以氢键和疏水作用键形式较好地结合，且根据结合能打分，分数的绝对值越大，说明成分与蛋白结合的越好。由此推测中药赤芍的有效成分是通过靶向蛋白来发挥抗胃癌作用的。

综上所述，本研究通过将网络药理学和分子对接技术二者相结合的方法来探讨中药赤芍抗胃癌疾病的活性成分、靶点及其作用机制，说明赤芍是通过多靶点、多成分和多途径相互作用来治疗胃癌疾病的，为中药抗胃癌疾病的作用机制提供了理论上的参考和依据，后续还须对预测结果通过实验进一步的验证。

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