响应面优化超声波辅助提取荠菜维生素C工艺
时间：2022-12-06 09:20:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
吴海燕，施晓玲，袁秋梅，陈建军，袁春新
（1. 南通科技职业学院，江苏 南通 226007；
2. 南通市农村专业技术协会，江苏 南通 226007；
3. 南通市食品药品监督检验中心，江苏 南通 226006）
荠菜（Capsella bursa-pastoris.）是十字花科荠属草本植物，荠菜可全草入药，茎叶可食用[1-2]。野生荠菜在我国分布广泛，作为一种药食同源植物，近年来人工栽培发展迅速。荠菜含有黄酮、多糖、有机酸、生物碱、维生素、多酚等多种活性成分[3-10]，具有消炎、抗氧化、降低胆固醇和调节糖代谢等多种生物活性[4,8,11-15]。荠菜营养丰富，风味独特，质地柔嫩，药食兼备，深受消费者的喜爱。
荠菜中维生素C含量丰富[4]，维生素C是维持人体正常生理功能必不可少的营养物质之一，具有抗氧化等多种生理活性，有助于降低心血管疾病、糖尿病、某些癌症等慢性疾病的患病风险[16-17]。超声波辅助提取荠菜维生素C是利用声空化效应，提高提取溶剂中荠菜的渗透速度，并且能减少提取溶剂的使用量。与传统的提取法相比，超声波辅助提取时间短，提取溶剂使用量少，可以多个实验同时提取，效率高，提取物的损失降低[16,18]。目前超声波提取技术已逐渐应用于天然植物有效成分、生物活性成分的提取研究中[19-25]。
本实验采用超声波辅助草酸溶液提取荠菜中维生素C，考查草酸浓度、超声时间、超声温度、超声功率、料液比对荠菜维生素C提取的影响，通过响应面法优化提取工艺参数，旨在为荠菜中天然抗氧化剂的开发利用提供技术参考。
1.1 材料与仪器
荠菜（Capsella bursa-pastoris.）：江苏中宝食品有限公司；
Vc标准品（纯度≥99.0%）：Sigma公司；
草酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。
Waters双通道紫外检测器高效液相色谱仪：Waters公司；
HR2084 食品制样器：飞利浦公司；
隔膜真空泵：天津市腾达过滤器件厂；
超声仪器（KQ2200）：昆山市超声仪器有限公司；
电子天平（精确度0.1 mg）：Sartorius公司；
高速冷冻离心机（SL8R）：Thermo公司。
1.2 实验方法
1.2.1 维生素C含量的测定
高效液相色谱法测定维生素C含量[26]，以0.1%的草酸溶液为流动相，流速：1 mL/min，进样量：25 μL，柱温：25 ℃，样品经C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）分离，采用紫外检测器进行检测。
维生素C标准品用0.1%的草酸定容，制成浓度为2～20 μg/mL的VC标准待测溶液，以峰面积为纵坐标，以维生素C的浓度为横坐标，得到回归方程：y=75 480.2x-930.2。
1.2.2 维生素C的提取
准确称取100 g荠菜，加入100 mL的2%草酸溶液匀浆。称取5.00 g左右的匀浆样品放入100 mL的离心管中，加入一定量的草酸溶液，置于超声波仪器中一定温度超声一定时间后，在4 ℃下9 000 r/min离心2 min，上清液转移至100 mL的棕色容量瓶中，用0.1%草酸溶液定容，溶液用0.45 μm滤膜过滤后按1.2.1测定维生素C的峰面积，代入回归方程求出荠菜的浓度，按下式计算维生素C的提取量。
式中：c为稀释后提取液维生素C的浓度，μg/mL；
V为样品溶液的定容体积，mL；
m为称取的荠菜匀浆液中相当于荠菜的质量，g。
1.2.3 实验设计
根据文献讨论，选择提取溶剂草酸的浓度、超声时间、超声温度、超声功率、料液比等五个影响提取量的因素，对提取工艺过程进行优化[7,9,19]。
1.2.3.1 单因素实验 将荠菜匀浆样品放入100 mL的离心管中，考察提取液草酸浓度（0.5%、1%、2%和3%），超声时间（5、10、15、20和25 min），超声温度（20、25、30、35和40 ℃），超声功率（20、25、30、35和40 W），料液比（1∶5、1∶10、1∶15和1∶20）对维生素C的提取量影响，每次超声处理匀浆荠菜5 g。
1.2.3.2 二水平实验 超声辅助提取实验影响因子多，采用全因子实验设计会影响实验效率[27]，采用部分因子实验可以确定影响提取量的主效应因子。在单因素实验的基础上确定各因素两个合适水平值，以维生素C的提取量为考察指标，采用SAS软件中的Confounded Fractional Factorial designs来确定影响提取工艺过程的主要因素以及因素间交互作用的一级作用。
1.2.3.3 响应面分析 根据Box-Bohnken的中心组合设计原理，由二水平设计确定的主要因素各取3水平，设计了3因素3水平共15个实验点的响应面分析[19]。
1.3 数据分析
数据处理使用软件Excel 2010和SAS 9.0进行数据分析，绘图采用Origin-2022，所有实验都重复3次，结果用平均值表示。
2.1 单因素实验
单因素实验，各因素对维生素C的提取量的影响结果见表1～5。
表1 草酸浓度对维生素C提取量的影响Table 1 Effects of oxalic acid concentration on extraction of Vitamin C
表2 超声时间对维生素C提取量的影响Table 2 Effects of ultrasonic time on extraction of Vitamin C
表4 超声功率对维生素C提取量的影响Table 4 Effects of ultrasonic power on extraction of Vitamin C
草酸浓度在0.5%～1%之间，维生素C的提取量快速增加，随后随着酸浓度增大，维生素C的量有所下降。可能原因是一定浓度酸能够保护维生素C不受外界环境影响而降解；
酸浓度过大，反而使维生素C溶出有所减少。
表5 料液比对维生素C提取量的影响Table 5 Effects of material to solvent ratio on extraction of Vitamin C
随着超声时间延长，维生素C的提取量是先增大后减少，在超声15 min提取量最大；
随着超声温度升高，维生素C的提取量是先增大后减少，在超声温度为30 ℃提取量最大。可能原因是超声时间增加，温度升高都能增加了维生素C的溶出率；
但是超声时间继续增加，温度继续升高，可能导致维生素C的降解，反而使维生素C的提取量减少。
随着超声功率增加，维生素C的提取量增加，在100 W时达到最高值。因为超声效应会随着功率增加而增大，从而促进提取量增加。
随着提取溶液量增加，维生素C的提取量是先增大后减少，在料液比1∶10提取量最大。因为溶液增加，促进维生素C的溶出，但是溶液继续增加，减弱了超声效应，超声提取效率减低，从而使维生素C的提取量减少。
2.2 二水平实验
采用SAS软件中5因素、实验次数为8的Confounded Fractional Factorial designs来确定影响提取工艺过程的主要因素以及因素间交互作用的一级作用。根据单因素实验结果，同时考虑减少试剂使用量，每一个因素取一个相对高和一个相对低的水平，假定响应值在所选的水平区间内是近似线性的[13]，实验因素和水平见表6。
表6 二水平实验的水平安排Table 6 Factors and levels for Fractional Factorial designs
SAS软件的Confounded Fractional Factorial designs实验结果见表7。
表7 部分因子实验结果Table 7 Experimental design and results of Fractional Factorial designs
SAS软件提供各因素的主效应（其他因素不变时，某单个因素的变化对响应值的影响）见图1。
图1 各因素的主效应图Fig.1 Main effect of all the factors
由图1可以看出，在选定的实验范围内，提取酸的浓度对提取量影响较小；
超声时间、超声温度提取维生素C的影响是负相关的，而超声功率、料液比对提取维生素C的影响是正相关的。对各因素的方差分析，如表8。
表8 各因素的方差分析Table 8 Analysis of variance for all the factors
由表3可知：在所有因素中，X2（超声时间）、X3（超声温度）、X5（料液比）对维生素C的影响显著，因此取上述三个因素作为主要因素做下一步优化实验。利用SAS软件考察主要因素之间的交互作用如图2所示。
表3 超声温度对维生素C提取量的影响Table 3 Effects of ultrasonic temperature on extraction of Vitamin C
图2 主因素间的交互作用图Fig.2 3-way interaction of main factors
由图2可以看出两个因素的值变化对提取量的影响，交互作用图中两直线交叉表示两者有交互作用，平行表示二者没有交互作用。在影响维生素C提取的主要因素中，超声时间与超声温度之间；
超声时间与料液比之间有交互作用。超声温度与料液比之间不存在交互作用。可能存在的原因是：料液比会影响超声空化效果；
超声时间越长，可能产生放热，影响维生素C的提取量。
2.3 响应面优化实验
利用响应面分析法对Confounded Fractional Factorial designs中所确定的主要影响因素：超声时间、超声温度、料液比作进一步的优化。草酸的浓度为1%，超声功率为100 W，其他三个重要因素根据单因素实验结果进行编码，各因素编码见表9。
表9 Box-Behnken实验设计的因素水平及结果Table 9 Experimental design of Box-Behnken designs
根据Box-Behnken的中心组合设计原理，设计3因素3水平共l5个实验点的响应面分析实验，在中心值重复3次实验，用以估计实验误差[19]，结果见表10。
表10 Box-Behnken实验设计与结果Table 10 Experimental design and results of Box-Behnken designs
SAS对数据进行回归分析，结果如表11。
表11 Box-Behnken实验设计的回归分析Table 11 Regression analysis of Box-Behnken designs
由表11可见，三因素对维生素C提取的过程的影响并非简单的一次线性关系，而是呈二次抛物面关系。一次超声温度（X1）、超声时间（X2）对提取效果的影响显著；
而在交叉乘积项上超声温度的平方（X1X1）、超声温度的平方（X2X2）、料液比的平方（X3X3）对提取效果的影响显著；
交互项上X1X2对提取效果有影响。各因素经回归拟合后，得回归方程：
Y=54.67+1.116 25X1+1.098 75X2-0.507 5X3-2.938 75X1X1+1.237 5X1X2-0.035X1X3-2.673 75X2X2-0.22X2X3-2.286 25X3X3
对回归方程进行可信度分析，模型可信度分析的统计检验结果见表12。
表12 模型可信度分析表Table 12 Fit statistics for Model
由表7可知，模型拟合系数的为96.01%，说明由这三个因素及其二次项构成的回归方程能解释提取量Y变化的96.01%，模型误差的平方根0.890 1，模型拟合度很好。
利用SAS软件对各因素的主效应分析，结果如图3所示。
图3 主要因素的主效应图Fig.3 Main effect of major factors
由图3可知，X1、X2、X3在低含量时，随着其值的增大响应值Y增大，在高含量时，随着其值的增大响应值Y反而降低，并且在选定的实验水平内存在顶点，由此可知，在选定的区域，响应值Y存在最大值。
提取量对响应因子的立体图见图4。
由图4可知，提取量对各因素的立体图均是开口向下的曲面图，说明在选定的实验区域，维生素C的提取量存在最大值。利用SAS分析可知，回归模型存在稳定点（X1，X2，X3）为（0.5，0.5，0），提取维生素C的目标值为54.68 mg/100 g。
图4 各因素的响应因子的立体图Fig.4 Surface plots of all the factors
为了验证模型预测的准确性，根据各因素的实验编码水平，将超声温度取32 ℃，超声时间12 min，料液比1∶10条件下进行提取维生素C，重复三次实验，得到维生素C为（54.88±0.22）mg/100 g，与预测值相比，相对误差为0.366%，说明该方程与实际情况拟合较好，证实了响应面优化的模型可靠性，响应面法适用于对超声波辅助提取工艺进行回归分析和参数优化。
1）实验证明，二水平实验和响应面分析法对提取工艺的优化是有效。二水平实验用较少的实验对影响提取工艺的多个因素进行考察，找出了影响超声波提取维生素C的影响主要因素，分别为超声温度、超声时间、料液比。
通过响应面实验对二水平实验选出的3个主要因素进一步优化，找出超声温度、超声时间、料液比与提取维生素C之间关系的数学模型：
该模型的回归效果显著，模型拟合程度很好，能很好地预测三个主要因素对超声波辅助提取工艺的影响。
2）SAS软件分析主要因素与提取维生素C之间的数学模型在稳定的条件下，提取维生素C存在最大值。优化的最佳反应条件为：超声温度取32 ℃，超声时间12 min，料液比1∶10，提取液草酸浓度为1%，超声波功率100 W，在此条件下进行提取荠菜中维生素C的提取量为（54.88±0.22）mg/100 g，与预测值相比，相对误差为0.366%，说明该响应面法优化的方程与实际情况拟合较好，证实了响应面优化模型的可靠性。
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