银铜双金属/组氨酸功能化石墨烯量子点/石墨烯杂化物的制备及其在电化学法测定黄瓜中毒死蜱、克百威和多菌灵上的应用

徐 丹 ,DJIMA Hassan Ali ,李瑞怡 ,李在均

(1.江南大学 化学与材料工程学院,无锡 214122;2.南京中医药大学 翰林学院,泰州 225300;3.江南大学 生命科学与健康工程学院,无锡 214122)

经常食用蔬菜会给人体健康带来很多益处,比如增强人体免疫力,预防糖尿病、便秘、心血管疾病和结肠癌等[1],其中黄瓜是人们喜爱的蔬菜之一。在黄瓜种植过程中,为了有效地避免黄瓜被害虫破坏,提高黄瓜的产量,广泛使用了各种农药,导致黄瓜中残留大量农药,进而对人类健康构成严重威胁,且对环境造成严重的破坏。因此,开发一种简单、快速和灵敏度高的方法用于黄瓜中农药残留量的测定是非常有意义的。目前常用于农药残留检测的方法有高效液相色谱法、气相色谱法、拉曼光谱法、荧光光谱法以及电化学法[2-6]。采用色谱法以及光谱法时,需要昂贵的仪器、专业的人员以及繁琐的样品预处理步骤[7]。电化学适配体传感器是通过敏感物质(适配体)来对不同浓度水平的靶标进行测定,并将对靶标的识别转化为可检测的物理信号[8],具有简单、快速、灵敏度高、成本低、选择性好以及可小型化等优点[9],被广泛用于农药残留的测定。而对于适配体传感器的构建,电极材料对其性能的影响起到非常重要的作用。

近年来,石墨烯由于具有大的比表面积、良好的导电性以及较好的化学稳定性,被广泛用于电化学适配体传感器的构建,是一种出色的传感材料,如文献[10]中通过氧化石墨烯构建了电化学适配体传感器,用于甲胎蛋白的测定。然而石墨烯很容易通过π-π堆叠发生团聚,导致活性面积减小。为了解决这个问题,将石墨烯与金属纳米粒子结合,不仅可有效改善石墨烯片的团聚,增大活性面积,还可通过石墨烯与金属纳米粒子之间的协同作用有效地提高传感器的性能。如文献[11]通过氧化石墨烯与银纳米粒子结合形成的复合物构建适配体传感器,用于地高辛的测定,氧化石墨烯与银纳米粒子之间的相互作用,极大提高了传感器的性能;文献[12]在羧基化的氧化石墨烯上电沉积金-钯双金属纳米粒子,构建的适配体传感器用于MUC1蛋白测定,该复合材料极大提高了传感器的性能,检出限达到了0.79 fmol·m L－1。尽管通过石墨烯与金属的结合可以改善传感器的性能,但是常出现金属纳米粒子在石墨烯片上不均匀分布、部分团聚的现象,这极大地降低了传感器的导电性。因此,制备金属纳米粒子在石墨烯片上均匀分散的复合材料是提高传感器的关键。

本工作制备了银铜双金属/组氨酸功能化石墨烯量子点(His-GQD)/石墨烯杂化物(AgCu/His-GQD/G),合成的杂化物提供了三维结构,且银和铜纳米粒子均匀地分散在石墨烯片上。基于AgCu/His-GQD/G 构建了电化学适配体传感器,该方法成功地用于黄瓜中克百威、毒死蜱和多菌灵的测定,并表现出高的灵敏度和选择性。

1.1 仪器与试剂

S4800型场发射扫描电子显微镜(SEM);JEM-2100型透射电子显微镜(TEM);D8 Advance型X射线衍射(XRD)仪;CHI660D 型电化学工作站;In-Via型显微共焦激光拉曼光谱仪。

三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl缓冲液(pH 7.4),包含0.1 mol·L－1NaCl、5.0 mmol·L－1KCl和5.0 mmol·L－1MgCl2;Tris-乙二胺 四乙酸(EDTA)缓冲液,包含10 mmol·L－1Tris-HCl和1 mmol·L－1EDTA。

毒死蜱标准溶液系列:称取9.56 mg毒死蜱标准品置于烧杯中,用甲醇溶解,并转移至50 mL 容量瓶中定容,摇匀。使用时,以水为溶剂,逐级稀释至质量浓度分别为1.00×10－2,5.00×10－2,1.00×10－1,5.00×10－1,1.00,5.00,1.00×10,1.00×102,5.00×102,1.00×103pmol·L－1的毒死蜱标准溶液系列。

多菌灵适配体,5′-(NH2)-(CH2)6-GGGCACACAACAACCGATGGTCCAGCCACCCGAATGACCAGCCCACCCGCCACCCCGCG-3′;克百威适配体,5′-(NH2)-(CH2)6-CACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAAGAGAACACTGGGGCAG ATATGGGCCAGCAGGTC-3′;毒死蜱适配体,5′-(NH2)-(CH2)6-CCTGCCACGCTCCGCAAGCTTAGGGTTACGCCTGCAGCGATTCTTGATCGCGCTGCTGGTAATCCTTC TTTAAGCTTGGCACCCGCATCGT-3′;毒死蜱标准品、克百威标准品、多菌灵标准品的纯度均为98%、马拉硫磷(MAL)、杀螟硫磷(BOR)、二嗪农(DIA)、辛硫磷(PHO)、西维因(CAR)、柠檬酸、组氨酸、磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4,10 mmol·L－1)、Ag NO3、Cu(NO3)2·3H2O、壳聚糖、4-巯基己醇(MCH)均为分析纯;试验用水为二次蒸馏水。

黄瓜样品购自某菜场。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 结构表征

采用SEM 观察形貌,测试电压为3 k V;采用TEM 观察微观结构,测试电压为200 k V;采用XRD 分析结构,Cu 靶Kα射线,扫描范围为5°～90°,扫描速率为2°·min－1;拉曼光谱测试采用In-Via型显微共焦激光拉曼光谱仪。

1.2.2 电化学测定

电化学试验在CHI660D 型电化学工作站三电极体系中进行,修饰后的玻碳电极(GCE)作为工作电极,银/氯化银电极作为参比电极,铂丝作为对电极。所有试验均在含 5 mmol · L－1[Fe(CN)6]3－/4－([Fe(CN)6]3－与[Fe(CN)6])4－的混合物)的PBS(pH 7.4)底液中测定。循环伏安法(CV)的扫描范围－0.1～0.7 V,扫描速 率100 m V·s－1;电化学阻抗(EIS)在频率1～100 k Hz,电位正弦波信号振幅±5 m V 条件下测定;差分脉冲伏安法(DPV)在0.6 V 内扫描。

1.3 试验方法

1.3.1 AgCu/His-GQD/G 的制备

氧化石墨烯通过Hummers法获得[13]。His-GQD根据文献[14]报道方法制备。0.5 g氧化石墨烯分散在150 mL 水中以形成均匀的分散液。接着,缓慢加入14 g·L－1His-GQD 溶液50 mL,用1 mol·L－1NaOH 溶液调节至pH 7.0后,缓慢加入4 mL 的0.1 mol·L－1Ag NO3溶液和3 mL 的0.1 mol·L－1Cu(NO3)2溶液的混合液,形成复合物,以转速6 000 r·min－1离心,并用水洗涤数次。收集的固体置于50 ℃真空干燥箱中干燥,最后于400 ℃热还原2 h,得到AgCu/His-GQD/G。

1.3.2 适配体传感器的制备

GCE(直径2.0 mm)用0.05 mm Al2O3抛光处理,接着在水和乙醇中分别超声5 min,用氮气吹干备 用。将20 mg AgCu/His-GQD/G 分散于10 mL的1% (质量分数)壳聚糖溶液中,超声30 min。取5μL溶液滴加到预处理好的GCE表面,室温下自然干燥后,滴加5μL的8μmol·L－1毒死蜱适配体溶液,于4 ℃放置12 h,接着用PBS(pH 7.4)冲洗电极表面,向电极表面滴加1 mmol·L－1MCH 溶液5μL以封堵非活性位点。将制备好的适配体传感器置于4℃冰箱中保存备用。同法制备克百威和多菌灵适配体传感器。

1.3.3 毒死蜱、克百威和多菌灵的测定

1)标准品的测定 将5μL毒死蜱标准溶液滴加到适配体传感器表面,在室温下温育40 min,然后使用PBS(pH 7.4)冲洗电极表面,使用DPV 在含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)底液中测定。同法测定克百威和多菌灵标准溶液。

2)黄瓜样品的测定 黄瓜的预处理参照文献[15]方法,将黄瓜洗干净,切成小块,放入榨汁机中榨汁,然后以转速8 000 r·min－1离心,取上清液按照上述方法测定其中毒死蜱、克百威和多菌灵的含量。

2.1 AgCu/His-GQD/G 的制备

AgCu/His-GQD/G 的制备通过3 步完成。首先,将His-GQD 缓慢加至氧化石墨烯溶液中形成复合物,His-GQD 带有大量的羧基和羟基,可与氧化石墨烯上的含氧基团形成氢键。另外,通过His-GQD 上的咪唑环与氧化石墨烯上的苯环间的π-π作用,His-GQD 可均匀地固定在氧化石墨烯片上。同时,His-GQD 上大量的亲水基团使复合物具有良好的亲水性,从而获得均匀的分散液。接着,将Ag NO3和Cu(NO3)2的混合液缓慢加入上述溶液中,在此过程中,银离子和铜离子通过与His-GQD上咪唑环上的氮原子配位,均匀固定在氧化石墨烯片上。并且随着银离子和铜离子的不断加入,银离子和铜离子能与不同氧化石墨烯片上的咪唑环配位,导致石墨烯片的聚合,溶液出现沉淀现象,进而形成了三维石墨烯结构。最后,将获得的复合物在氮气保护下于400 ℃热还原。在加热过程中,氧化石墨烯上的大部分功能基团被分解。同时,复合物上的银离子和铜离子被还原成银原子和铜原子,最终形成银、铜纳米粒子,从而获得AgCu/His-GQD/G。

2.2 AgCu/His-GQD/G 的结构表征

AgCu/His-GQD/G 的结构通过SEM、TEM、XRD 以及拉曼光谱进行表征。图1(a)为AgCu/His-GQD/G 的SEM 图,可观察到AgCu/His-GQD/G 表现出三维结构,且银、铜纳米粒子均匀分散在石墨烯片上。His-GQD 的引入提高了银、铜纳米粒子在石墨烯片上的分散度,使更多的活性位点暴露,提高了复合材料的催化性能。此外,银、铜纳米粒子引入到石墨烯的片层中间,可以有效地阻止石墨烯片的团聚。图1(b)为AgCu/His-GQD/G 的TEM 图,可观察到银、铜纳米粒子均匀分散在石墨烯片上,纳米粒子的尺寸为(20±5)nm。图1(c)为AgCu/His-GQD/G 的XRD 图,其中26.0°为石墨烯的(002)晶 面,38.4°,44.7°,64.8°,77.7°对应银 的(111)、(200)、(220)、(311)晶面,43.5°,50.6°,74.1°对应铜的(111)、(200)、(220)晶面。图1(d)为AgCu/His-GQD/G 的拉曼光谱,1 357 cm－1和1 598 cm－1分别对应的是石墨烯的D 带和G 带。

图1 AgCu/His-GQD/G 的SEM、TEM、XRD和拉曼光谱Fig.1 SEM,TEM,XRD and Raman spectrum of AgCu/His-GQD/G

2.3 适配体传感器的构建及电化学行为

基于AgCu/His-GQD/G 构建的适配体传感器用于毒死蜱的测定,其原理如图2所示。首先,以壳聚糖作为交联剂,将AgCu/His-GQD/G 修饰到GCE表面,然后修饰毒死蜱适配体,适配体可以通过氨基与银、铜作用而固定到电极表面。最后,使用MCH 封堵非活性位点。AgCu/His-GQD/G 具有三维结构,并且因银、铜纳米粒子均匀分布在石墨烯片上而提供了丰富的活性位点,提高了该适配体传感器的灵敏度。克百威和多菌灵适配体传感器的构建原理与毒死蜱的相同。

图2 制备的适配体传感器用于测定毒死蜱的原理图Fig.2 Schematic diagram of the prepared aptamer sensor for the determination of chlorpyrifos

适配体传感器的构建过程通过CV 和EIS进行研 究。CV 和EIS 在含有5 mmol· L－1的[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中进行测定,结果见图3。

由图3可知:GCE 显示出一对氧化还原峰(曲线1);当AgCu/His-GQD/G 修饰到电极表面后,在CV 曲线上的峰电流明显增加,而在EIS曲线上的电荷转移电阻Rct减小(曲线2),这是由于AgCu/His-GQD/G 高的电导率加快了[Fe(CN)6]3－/4－氧化还原;当毒死蜱适配体修饰到电极表面,CV 峰电流明显降低,EIS曲线上的Rct升高(曲线3),这是因为带有负电荷的适配体阻碍了[Fe(CN)6]3－/4－的氧化还原。MCH 封堵非活性位点后,CV 峰值电流降低并且Rct增加(曲线4)。由此说明适配体传感器构建成功。

图3 CV 曲线和EIS曲线Fig.3 CV curves and EIS curves

2.4 电化学响应

将构建的适配体传感器置于含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中,通 过CV 和DPV 测定1.00 pmol·L－1毒死蜱标准溶液,结果见图4。

图4 适配体传感器与毒死蜱温育前后的CV 曲线和DPV 曲线Fig.4 CV curves and DPV curves of aptamer sensor and chlorpyrifos before and after incubation

由图4可知,当毒死蜱接触到修饰电极表面以后,CV 和DPV 峰电流绝对值都减小,这是由于适配体与毒死蜱结合形成弱导电性复合物,极大阻碍了电解质与电极表面的电子传递,导致CV 和DPV的电流都减小。此外,温育前后毒死蜱在修饰电极上DPV 的信号变化高于CV 的。因此,选择DPV测定毒死蜱、克百威和多菌灵的含量。

2.5 适配体浓度和温育时间的优化

为了获得更好的传感器性能,试验考察了适配体浓度(2,4,6,7,8,9,10μmol·L－1)和温育时间(10,20,30,35,40,50,60 min)对适配体传感器在含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中测定0.1 pmol·L－1毒死蜱产生DPV 响应的影响。

结果表明:随着适配体浓度的增加,适配体传感器与毒死蜱温育前后DPV 峰电流的变化(ΔIp)随之增加;当适配体浓度增加至8μmol·L－1时,ΔIp达到最大值,并保持稳定,这是由于随着适配体浓度增加,更多的毒死蜱与适配体结合形成复合物,弱导电性的复合物导致出现更小的电流、更大的ΔIp;当浓度超过8μmol·L－1时,ΔIp几乎不变,说明电极表面的适配体的量足以捕捉到所有的毒死蜱。随着温育时间的延长,ΔIp随之增加,这是由于随着温育时间的增加,电极表面可以捕捉更多的毒死蜱,更多的适配体-毒死蜱复合物的形成带来更小的DPV 电流、更大的ΔIp;当温育时间超过40 min,ΔIp几乎不变。因此,试验选择适配体浓度为8μmol·L－1,温育时间为40 min。

2.6 选择性试验

黄瓜中可能存在其他农药,如MAL、BOR、DIA、PHO 和CAR 等,试验考察了上述农药对使用适配体传感器测定毒死蜱、克百威、多菌灵的影响。以测定毒死蜱为例,试验考察了使用构建的适配体传感器 对0.1 pmol·L－1的MAL、BOR、DIA、PHO、CAR、毒死蜱溶液及上述各物质的混合溶液的DPV 峰电流响应。结果表明:在混合溶液条件下所得的DPV 峰电流与毒死蜱条件下所得的DPV峰电流基本一致;而在MAL、BOR、DIA、PHO、CAR单独存在条件下所得DPV 峰电流很小。采用相同的方法考察了适配体传感器对多菌灵和克百威测定的选择性,得到相同的结果。表明所构建的适配体传感器具有良好的选择性。

2.7 标准曲线和检出限

在最佳条件下,试验考察了构建的适配体传感器对毒死蜱标准溶液系列在含5 mmol·L－1[Fe(CN)6]3－/4－的PBS(pH 7.4)中的DPV 行为,结果显示,随着毒死蜱浓度的增加,峰电流绝对值随之减小,且在1.00×10－2～1.00×103pmol·L－1内毒死蜱浓度的负对数与对应的DPV 峰电流呈线性关系,线性回归方程和相关系数见表1。同样的方法用于测定克百威和多菌灵,其线性参数见表1。

按照3倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(3S/N),结果见表1。

表1 线性参数和检出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.8 重复性和稳定性试验

试验分别构建5个适配体传感器对相同浓度的毒死蜱、多菌灵、克百威的DPV响应进行测定,考察了适配体传感器的重复性。结果表明,毒死蜱、多菌灵、克百威的DPV 响应测定值的相对标准偏差(RSD)分别为1.5%,2.1%,1.7%,说明构建的适配体传感器具有良好的重复性。

同样,对适配体传感器的稳定性进行了考察。将AgCu/His-GQD/G 修饰到电极上,然后修饰毒死蜱适配体,对0.10 pmol·L－1毒死蜱溶液进行DPV 测定,重复测定8 次,其测定结果的RSD 为1.2%。使用同样方法构建传感器用于测定10 pmol·L－1多菌灵溶液和10 pmol·L－1克百威溶液,RSD 分别为0.090%和1.1%。此外,将构建的适配体传感器置于4 ℃冰箱中放置15 d,其峰电流能够保持起始值的98.7%,98.3%,98.6%,说明构建的适配体传感器具有良好的稳定性。

2.9 样品分析及回收试验

按照试验方法测定两个黄瓜样品中毒死蜱、克百威和多菌灵的含量,并进行加标回收试验,计算回收率和测定值的RSD,结果见表2。

表2 样品分析及回收试验结果(n＝5)Tab.2 Analytical results of the samples and results of test for recovery(n＝5)

由表2可知:黄瓜样品中仅检出多菌灵,检出量分别为1.21,1.25 pmol·L－1;毒死蜱、克百威和多菌灵的回收率为99.3%～100%,说明方法具有较高的准确度。

2.10 方法对比

将本方法与已报道的不同修饰电极构建的传感器用于测定毒死蜱、克百威和多菌灵的方法进行对比,结果见表3。

表3 方法对比结果Tab.3 Comparison results of different methods

由表3可知,本方法表现出更高的灵敏度。本工作制备了AgCu/His-GQD/G,使用His-GQD实现银、铜纳米粒子在石墨烯片上的固定和分散。该杂化物提供了三维结构,并且银、铜纳米粒子在石墨烯片上均匀分散。基于该杂化物构建适配体传感器用于毒死蜱、克百威和多菌灵的测定,表现出高的灵敏度和选择性。

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