翻堆频次对奶牛粪污异位发酵床中抗生素抗性基因的影响

崔华威，龚萍，郜道玉，周源，华娟，邵志勇，陈洁，万平民，金尔光，李自力

1.武汉市农业科学院畜牧兽医研究所，武汉 430208；
2.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；
3.长江大学动物科学学院，荆州 434023

抗生素类药物在畜禽疾病防治及促生长方面发挥了积极作用，但进入体内的抗生素类药物仅少量被吸收利用，绝大部分抗生素类药物及产生的抗性基因（antibiotic resistance genes，ARGs）随粪尿排出体外，粪尿中残留抗生素类药物的选择压力可能诱导微生物再次产生ARGs[1]。畜禽粪污（粪尿和污水等）中的ARGs可通过基因垂直传播或水平转移在微生物间传播扩散，并通过雨水径流、渗滤、还田利用等方式进入生态环境，污染土壤、水体、农作物等，进而进入食物链对公共健康构成潜在威胁[2]。

异位发酵床技术是以微生物好氧发酵为基础，结合原位发酵床和好氧堆肥形成的新型粪污处理技术，以锯末、谷壳、砻糠等为垫料，通过接种复合微生物菌剂和连续添加粪污方式，实现粪便和污水异地的动态堆肥。翻堆是异位发酵床动态堆肥的保障，通过翻堆可补充粪污，增加通气量，为微生物增殖提供养分和氧气，调节温度变化，调整微生物群落结构，促进物料的分解，提高ARGs等污染物的消减或去除效果。近年来，对粪污异位发酵床中ARGs的变化也进行了一些研究，如李可心等[3]研究了谷壳+锯末和酒糟垫料异位发酵床对猪粪中四环素类抗性基因和整合子基因intI1绝对丰度的影响，李艳苓[4]研究了异位发酵床对猪场粪污中土霉素抗性基因的去除作用，但翻堆次数对粪污异位发酵床中ARGs影响的报道较少，仅见到张锦[5]报道实验室堆肥2 d翻堆1次可显著降低猪粪中ermB、ermC等基因的相对丰度。本研究以奶牛粪污异位发酵床为研究对象，探讨翻堆次数对粪污堆肥降解过程中ARGs的影响，以期为应用异位发酵床堆肥过程中降低ARGs的扩散传播风险及粪污降解产物的安全利用提供参考。

1.1 试验材料及主要试剂

粪污（包括粪便、尿液及生产污水，含水量约90%）和异位发酵床垫料（锯末、谷壳、砻糠）来自湖北省某奶牛场。微生物菌剂（含芽孢杆菌、粪球菌、乳酸菌和酵母菌等，总菌量≥1×1010CFU/g）由武汉旭润环保科技有限公司提供。

土壤DNA提取试剂盒购自TIANGEN公司，TaqDNA聚合酶购自大连宝生物公司（TaKaRa），Agarose琼脂糖（100 g/瓶）购自北京索莱宝科技有限公司，iTaq Universal SYBR Green Supermix购自上海根生生物科技有限公司，抗生素抗性基因引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.2 试验设计

根据奶牛场异位发酵床生产方式，于2020年7月29日至9月27日采用无盖塑料盒在雨棚内开展试验。塑料盒总容积0.7 m3（高765 mm、上外径1 060 mm、下外径950 mm），底部留有12个直径1 cm小孔。垫料总体积0.5 m3，谷壳、锯末、砻糠按体积比2∶1∶1添加，并根据各自质量和含水量计算出垫料总质量为60 kg，含水量12%。然后添加60 kg粪污（含水量90%）及150 g菌剂、1 500 g尿素，调整物料C/N为30∶1，混合均匀后装入塑料盒。试验期间，第1天添加粪污30 kg，第2～47天根据含水量变化调整粪污添加量（约4～8 kg/d）。

按翻堆频次分为2组，F1组：1 d翻堆1次；
F2组：2 d翻堆1次。

用实时数显温度仪垂直插入物料中心20～30 cm处监测温度，每天09：00记录实时数显温度仪温度及空气温湿度测定器的温度和湿度。

试验期间含水量控制在60%左右。采用微波炉加热法监测含水量，并根据含水量变化调整粪污添加量。

1.3 样品采集

分别于堆肥 0、5、12、26、33、40、47、61 d按上、中、下3层（分别距表面10、30、50 cm）采用五点采样法取样，混合均匀，再用四分法收集样品约500 g，密封于5号自封袋，置于-20℃保存。

1.4 DNA的提取

按TIANGEN土壤基因组DNA提取试剂盒（Fast DNA Spin kit for soil）操作手册分别提取上述样品DNA，检测DNA的浓度与纯度，-20℃保存备用。

1.5 PCR及定量PCR检测

PCR和qPCR引物设计参照文献[6]，引物序列、片段大小及退火温度见表1。根据奶牛场前期兽药使用情况，选择常见的15种目标基因进行PCR检测，包括2种四环素类（tetG、tetW）、3种磺胺类（sul1、sul2、dfrA1）、2种β-内酰胺类（blaTEM-1、fexA）、2种MLSB类（ermX、ermQ）、2种FCA类（optrA、IsaE）、1种氨基糖苷类（aac（6"）-Ib-cr）、1种整合子（intI1）和2种转座子（Tn916/1545、ISCR1）基因。PCR反应体系为基因组 DNA 1 μL ，2×mix（Taq）8.5 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.25 μL，双蒸水10 μL，总体积 20 μL。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s、退火30 s、72 ℃ 60 s，共35个循环，72 ℃ 10 min。配制1%琼脂糖凝胶，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

表1 PCR和qPCR引物序列、片段大小及退火温度Table 1 PCR and qPCR primer sequence，fragment size and annealing temperature

对PCR检出率较高的7种基因（tetG、tetW、sul1、sul2、blaTEM-1、ermQ、intI1）进一步在ABI ViiA 7 Real Time PCR System荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR检测。反应体系为基因组DNA 1 μL，iTaq Universal SYBR Green Supermix（2×）10 μL，10 μmol/L的上下游引物各0.25 μL，双蒸水 8.5 μL，总体积20 μL。反应条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s、60 ℃30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环，65 ℃延伸5 s。每个样品3个重复。

1.6 数据处理和分析

采用SPSS（v19.0）、EXCEL（2016）等进行统计分析，Origin 8.0绘图。

2.1 粪污降解过程中的温度变化

粪污降解过程中温度变化见表2。从表2可看出，F1、F2组分别于第5、12天达到最高温度（60℃、64.5℃），第2～40天仍保持50℃以上，40 d后急剧下降，试验结束时接近环境温度。相对而言F2组的温度高于F1组，说明F2组更有利于保持较高的温度。畜禽粪污无害化处理技术规范（GB/T36195-2018）要求堆肥温度≥50℃不少于7 d，本研究中50℃以上温度超过7 d，达到粪污无害化处理的要求。

表2 粪污降解过程中的温度变化Table 2 Change of temperature during degradation of manure and sewage ℃

2.2 粪污降解过程中ARGs的种类变化

采用PCR方法检测了12种ARGs和3种MGEs。结果显示，2组样品中，除磺胺类dfrA1基因外，其余11种ARGs和3种MGEs均检出，其中sul1、sul2、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ、intI1的检出率较高。粪污降解过程中，目标基因种类整体上随温度的升高而减少或降低而增加（表3）。F1、F2组0～5 d均检出12种目标基因，12～40 d可检出的种类逐步减少，分别于第33、40天减少至1种，40 d后明显增加，61 d时分别增加至9、10种。

表3 粪污降解过程中ARGs种类的变化Table 3 Changes of ARGs species during degradation of manure and sewage

2.3 粪污降解过程中ARGs和MGEs相对丰度变化

1）目标基因总相对丰度变化。采用qPCR检测了 6种 ARGs（sul1、sul2、tetG、tetW、blaTEM-1、ermQ）及1种MGEs（intI1）的相对丰度，F1和F2组目标基因总相对丰度整体上呈先降低后升高再降低的变化趋势（图1）。F1组（图1A）0～26 d逐步降低，26～47 d逐步升高，47～61 d快速降低，其中，26、33 d较0 d分别降低81.63%、74.04%；
F2组（图1B）0～40 d逐渐降低，40～47 d大幅度增加，47～61 d降低，其中33、40 d较0 d分别降低82.06%、86.91%。试验结束时，F1、F2组ARGs总相对丰度较0 d分别降低82.33%、78.89%。相对来看，高温期F2组降低目标基因总相对丰度的效果较好，说明持续保持相对较高的温度可能有利于低目标基因的丰度。

图1 粪污降解过程中F1（A）、F2（B）组ARGs和MGEs的变化Fig.1 Changes of ARGs and MGEs in group F1（A）and F2（B）during degradation of manure and sewage

2）tetG和tetW的相对丰度变化。粪污降解过程中tetG和tetW的相对丰度变化见图2。F1组中tetG的相对丰度呈现降低-升高-降低-升高-降低的变化，F2组则为降低-升高-降低的变化趋势（图2A），试验结束时，F1、F2组较0 d分别降低16.51%（P＞0.05）、64.32%（P＜0.01）。

F1组 ，5 d时 大 幅 降 低（88.57%），而12～33 d和47 d均不同程度高于0 d，其中33 d比0 d高5.68倍（P＜0.05）；
F2组，0～40 d逐步降低，40～47 d逐步增加后再降低，其中33、40 d较0 d分别降低82.27%、83.39%（P＜0.01）。

图2 粪污降解过程中tetG（A）和tetW（B）的变化Fig.2 Changes of tetG（A）and tetW（B）during degradation of manure and sewage

F1、F2组中tetW整体呈降低变化趋势（图2B），试验结束时，与0 d比较分别降低87.89%、99.46%（P＜0.01）。F1组，0 d相对丰度为0.950 3，12 d极显著降低（97.33%，P＜0.01），26～33 d低于检测限，40～61 d小幅缓慢上升；
F2组，0 d相对丰度为0.702 6，0～40 d逐步降低，其中33、40 d极显著降低（99.40%、99.13%，P＜0.01），40～47 d逐步升高，61 d再次降低至极低水平。

整体上，F1和F2组均可不同程度降低tetG（16.51%和64.32%）、tetW（87.89%和99.46%）的相对丰度，且F2组可较好地去除tetG、tetW，尤其是高温期。

3）sul1和sul2的相对丰度变化。磺胺类抗性基因sul1、sul2相对丰度变化如图3所示。试验结束时，F1、F2组sul1相对丰度较0 d分别降低54.58%、50.91%（P＞0.05）。F1组0～33 d及61 d不同程度降低，40～47 d快速升高且极显著高于0 d（199.50%、225.62%，P＜0.01）；
F2组0～5 d、12～40 d和61 d不同程度降低，其中12～26 d、47 d升高至高于0 d（图3A）。

图3 粪污降解过程中sul1（A）和sul2（B）的变化Fig.3 Changes of sul1（A）and sul2（B）during degradation of manure and sewage

F1组初始样品中sul2的相对丰度较低，F2组较高（图3B），试验结束时与0 d比较，F1组中增加327.33%（P＜0.05），F2组降低30.87%（P＞0.05）。F1组除0～12 d降低外，其余时间点均升高至高于0 d，其中47 d最高（增加495.69%，P＜0.01）；
F2组0～40 d和47～61 d不同程度降低，47 d突然增加至高于0 d（增加67.61%，P＜0.05），然后再降低。

试验结束时，F1和F2组中sul1的相对丰度均降低（54.58%和50.91%），但sul2的丰度变化有较大差别（-327.33%和30.87%），说明F1和F2组均可较好地去除sul1，但去除sul2的效果不理想。相比较来看，F2组可较好地降低sul1、sul2的丰度。

4）blaTEM-1和ermQ的相对丰度变化。粪污降解过程中blaTEM-1相对丰度整体上降低（图4A）。F1组，5 d极显著升高（P＜0.01），然后快速降低，12～61 d极显著降低（P＜0.01），其中61 d低于检测限；
F2组0～40 d逐步降低，40～47 d升高后在降低。试验结束时，与0 d比较，F1组低于检测限，F2组降低99.29%（P＜0.01）。

ermQ的相对丰度变化如图4B。初始样品中，F1组较高（0.690 2），F2组较低（0.328 4），试验结束时与0 d比较，F1、F2组分别降低 97.80%（P＜0.01）、82.22%（P＜0.05）。粪污降解过程中2组中ermQ相对丰度均不同程度降低，F1组在5、26和61 d相对丰度较0 d极显著降低（P＜0.01）；
F2组26～40 d以及61 d显著降低（P＜0.05）。

图4 粪污降解过程中blaTEM-1（A）和ermQ（B）的变化Fig.4 Changes of blaTEM-1（A）and ermQ（B）during degradation of manure and sewage

F1和F2组均可显著降低blaTEM-1、ermQ的相对丰度，且两组间无明显差别，说明2种翻堆方式均可有效去除blaTEM-1、ermQ，尤其是高温期。

5）整合子基因intI1的相对丰度变化。粪污降解过程中intI1的相对丰度变化见图5。试验结束时，F1、F2组intI1的相对丰度分别降低59.29%（P＞0.05）和99.92%（P＜0.05）。F1组0～12 d降低，12～40 d逐渐升高，40 d后大幅度降低，其中5 d低于检测限，40 d升高至高于0 d（293.18%）；
F2组0～5 d和33～47 d表现为升高趋势，5～33 d和47～61 d呈降低趋势，其中26～33 d和61 d降低至极低水平。从intI1丰度的变化趋势来看，F1和F2组均可降低intI1的相对丰度，F2组去除intI1的效果更好（99.92%），尤其是高温期。

图5 粪污降解过程中intI1的变化Fig.5 Changes of intI1 during degradation of manure and sewage

研究表明，畜禽粪便堆肥过程中添加功能性菌剂[7]、调理剂[8]（如锯末、蘑菇渣、秸秆等）及翻堆[5]等有利于增强微生物活性，促进微生物增殖，改善微生物群落结构，并能提高堆肥温度，延长高温持续时间。本研究F1、F2组第2～40天均维持50℃以上温度，可能与异位发酵床垫料、添加复合菌剂、翻堆、微生物群落演替等有关；
F2组温度高于F1组，可能与2 d翻堆1次有利于减少热量散失和保温、促进微生物的活动等有关。关于菌剂及添加量、垫料组成等对发酵床中微生物演替规律、温度和高温持续时间的影响有待于进一步研究。

武中庸[9]在奶牛运动场粪土混合物中检出18种耐药基因，其中sul1、sul2、aac（6"）-Ib-cr、ermB、tetM的检出率100%；
许继飞等[10]在奶牛粪便厌氧发酵原料中检出3种MGEs（intI1、intI2、Tn916/1545）基因；
Zhang等[11]在奶牛粪浆中检出8种ARGs（tetA、tetC、tetG、tetO、tetQ、tetT、tetW、tetX）和2种MGEs（intI2、Tn916/1545）。本研究除检出上述文献报道的四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、MLSB类抗性基因及MGEs的有关基因外，还检出FCA类（optrA和IsaE）、β-内酰胺类（blaTEM-1和fexA）及转座子基因ISCRI，这可能与生产过程中使用相关抗生素类药物或检测目标基因差异性等有关。

堆肥过程中产生的高温可杀灭/去除不耐热的ARGs宿主菌及破坏耐药质粒[12]、生物降解ARGs[13]，从而减少ARGs或MGEs数量[14-15]。本研究高温期（12～40 d）目标基因种类减少，其中F1组26 d减少至1种，F2组26～33 d减少1～2种，与Wu等[15]报道的堆肥（尤其是高温期）可有效减少ARGs多样性的结果类似，表明堆肥高温期可减少ARGs的种类。40 d后ARGs种类增加，可能与物料逐步腐熟，微生物活性降低，温度逐步下降，高温环境下被抑制的微生物恢复活性[16]及粪浆含有ARGs、或ARGs的类型等有关。

研究表明，堆肥过程中微生物群落结构变化是ARGs丰度变化的关键因素[17]，持续相对较高的温度可杀灭/去除携带ARGs的微生物及降解ARGs[18]，进而降低目标基因相对丰度。本研究高温阶段基因总相对丰度整体上下降，与Wang等[19]报道的堆肥高温期可明显降低ARGs丰度的结果相似，其中F1组第26天（81.63%）和F2组第40天（86.91%）明显降低，且F2组有一定优势，这可能与ARGs类型和丰度、持续较高的温度、微生物群落结构及丰度变化[20]等有关。

Qian等[21]报道，堆肥初期至高温期tetM、tetC、tetW、tetX、tetQ、sul1和sul2的相对含量逐渐降低，但高温期到腐熟期tetC、tetX、sul1、sul2的相对含量呈上升趋势。Cao等[22]发现，猪粪堆肥降温-腐熟阶段四环素类、磺胺类和氨基糖苷类抗性基因富集。本研究降温期基因总相对丰度变化与上述报道类似，这可能与有效养分减少，微生物群落活性降低，高温条件下某些ARGs和MGEs没有完全去除或持久存在，或携带ARGs的某些宿主菌恢复活性或积累[23]，或特定的ARGs富集或出现[15]，及持续补充粪污等有关。

研究表明，堆肥可降低大部分四环素类抗性基因如tetG、tetX的丰度[24-25]，但Peng等[26]等报道，堆肥降低了猪粪中tetW的相对丰度，增加了tetG的相对丰度。本研究F1、F2组tetW的相对丰度极显著降低，与上述报道基本一致，说明异位发酵可有效去除粪污中的tetW。tetG的相对丰度不同程度降低（16.51%、64.32%），与 Duan等[25]的报道相似，与Peng等[26]的报道不一致，可能与复合菌剂、粪污源及降解工艺、菌群结构变化、粪污补充等有关。F2组tetW、tetG的去除率（99.46%、64.32%）高于 F1（87.89%、16.51%），说明2 d翻堆1次可能有利于去除tetW、tetG。

有研究[21]报道，堆肥高温阶段磺胺类抗性基因（sul1、sul2）的丰度逐步降低，但在腐熟降温阶段不同程度增加。本研究高温阶段sul1和sul2相对丰度的整体变化趋势与上述报道相似，说明高温期可能有利于降低sul1和sul2的相对丰度。试验结束时，2组中sul1的相对丰度降低（54.58%、50.91%），但sul2相对丰度变化（F1：-327.33%，F2：30.87%）与Duan等[25]的结果有一定差别，说明两处理可较好地去除sul1，但去除sul2的效果不理想，这可能与磺胺类抗性基因的环境抗性强、携带磺胺类抗性基因的某些菌群耐高温或高温期未被完全去除[27]及不同条件下相同ARGs也会出现不一样的变化[28]等有关。F2组去除sul1和sul2的效果相对较好（50.91%、30.87%），可能与物料中sul1和sul2含量、翻堆频次、微生物菌群更替及更高温度等有关。对于粪污降解过程中2组间sul2丰度变化的差异性有待进一步研究。

Jang等[14]发现，高温好氧堆肥后污泥中β-内酰胺类抗性基因的去除率达80.02%～100%。郑宁国等[29]报道，高温堆肥可有效去除猪粪中β-内酰胺类抗性基因，但去除ermQ的效果不佳。本研究F1、F2组均可显著降低blaTEM-1和ermQ的相对丰度（低于检测限和97.80%、99.29%和82.22%），去除blaTEM-1的效果与上述报道一致，而去除ermQ的效果与郑宁国等[29]的结果不同，这可能与原料、处理工艺的差别及使用菌剂等有关，表明2种处理方式均可有效去除粪污中的blaTEM-1和ermQ。

intI1是ARGs水平转移的一个重要MGEs，降低intI1相对丰度可抑制ARGs的扩散和传播[23]。Li等[30]发现，堆肥降低鸡粪中intI1的丰度。Duan等[25]报道，添加0.5%枯草芽孢杆菌可显著降低牛粪堆肥产物中intI1的相对丰度，抑制ARGs的传播。与上述报道类似，试验结束时F1、F2组中intI1相对丰度均有不同程度降低（59.29%和99.92%），说明两处理均可较好地去除粪污中的intI1，其中F2的效果更好，可能与intI1不耐高温、相对更高的温度可促进intI1的去除[31]等有关。F1和F2组间的差异，可能与补充粪污及intI1含量、翻堆频次、细菌群落结构变化等有关。

综上，奶牛粪污异位发酵床中添加复合菌剂、2 d翻堆1次更有利于提高堆肥温度并延长高温持续时间，有利于去除粪污中大部分ARGs，降低ARGs传播扩散风险。

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