TLR4/HIF-1α信号通路介导糖化低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞损伤

邱军辉，刘美志，孙杜桑，潘 婷，赵维维，沙雯君，鲁 郡，雷 涛，

糖尿病是全球增长最快的疾病之一，预计到2045年将影响6.93亿成年人[1]。近年来，我国糖尿病的发病率逐年升高，其主要危害在于糖尿病的慢性并发症，而糖尿病最主要的慢性并发症是血管病变[2]。研究[3]显示血管内皮功能损伤既是血管病变的重要病理基础，也是糖尿病预后的决定性因素。糖尿病患者体内多同时存在高血糖和脂代谢紊乱状态，低密度脂蛋白极易发生非酶促糖基化，形成糖化低密度脂蛋白(glycated low density lipoprotein，Gly-LDL)[4]。Gly-LDL能够影响内皮细胞形态和功能，但具体作用机制尚未阐明。该研究旨在探讨Gly-LDL诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)炎症反应的具体机制，为防治血管内皮损伤提供新的理论依据。

1.1 材料

1.1.1细胞 HUVECs购自上海中科院细胞研究所。

1.1.2主要试剂 LDL Human购自广州奕元生物科技有限公司；
葡萄糖购自上海生工生物工程股份有限公司；
CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所；

ECM购自美国ScienCell公司；
0.25%胰酶消化液购自美国Gibco公司；
BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5×)购自上海碧云天生物科技有限公司；
ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；
TRIzol购自Invitrogen公司；

PrimeScriptTMRT Master Mix Kit和SYBR®Primix Ex TagTMKit购自美国TaKaRa公司；
Toll样受体4(toll like receptor 4,TLR4)、缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6) 、β-actin抗体、HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、HRP 标记的兔抗小鼠IgG二抗购自美国Abcam公司。

1.1.3主要仪器 细胞超净工作台购自ESCO公司；
全波长酶标仪购自Bio-Rad公司；
荧光显微镜购自美国莱卡公司；
电泳系统购自美国Bio-Rad公司；
离心机购自Eppendorf公司；
实时荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。

1.2 方法

1.2.1Gly-LDL的制备 参考文献[5]报道，在无菌条件下，将0.2 mol/L葡萄糖与2 g/L LDL Human在37 ℃培养箱中避光孵育4周，同时加入1 g/L EDTA和10 μmol/L二丁基羟基甲苯。第1、7、14、21、28天提取100 μl样品保存于-80 ℃，检测Gly-LDL水平。孵育完成后在pH 7.4 的PBS缓冲液中透析48 h备用。

1.2.2细胞培养 从液氮中取出冻存细胞，在37 ℃水浴锅中解冻并离心，用完全培养基复苏细胞，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2.3CCK-8法检测细胞增殖活力 将处于对数生长期的HUVECs制备细胞悬液，按照1×104个细胞/孔的密度将细胞悬液接种至96孔板中，每孔100 μl，每组设立5个重复孔。待细胞完全贴壁后，按照不同干预措施将细胞分为对照组、阳性对照组[50 mg/L普通低密度脂蛋白 (normal low density lipoprotein, n-LDL]、Gly-LDL (50、75、100 mg/L) 组，干预24 h后用含10% CCK-8的培养基进行换液，避光孵育，每隔30 min使用酶标仪测定每组在450 nm处的吸光度，取各组实验的平均值，重复3次实验。

1.2.4划痕实验检测细胞迁移能力 在6孔板中以2×105个细胞/孔的密度培养细胞，待细胞长至80%～90%时，用枪头于板底划线，PBS洗去漂浮细胞，更换含1%FBS低血清培养基后加入不同浓度Gly-LDL继续培养，于显微镜下拍摄0 h细胞划痕图片，12 h后在同一位置拍摄图片，计算划痕区域面积，求得愈合率。

1.2.5ELISA法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)含量 取24 h后各组细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书检测上清液中TNF-α、IL-6、VCAM-1、ICAM-1含量。

1.2.6qRT-PCR检测HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA水平 在6孔板中培养内皮细胞，干预24 h后收集各组内皮细胞，按说明书提取内皮细胞中总RNA，采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，实时荧光定量PCR进行目的基因扩增。PCR扩增体系：2×TB Green 10.0 μl，引物各0.4 μl，引物序列见表1，50×ROX ReferenceDye Ⅱ 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl，总体系20 μl。反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃退火5 s，60 ℃延伸34 s，共40个循环，95 ℃延伸15 s。以β-actin为内参，2-ΔΔCt计算。

表1 引物序列

1.2.7Western blot检测TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白水平 将3～4代HUVECs细胞接种于6孔板中，每孔2×105个细胞，待细胞长至80%时，将完全培养基更换成低血清培养基进行饥饿处理8 h，对细胞进行干预处理24 h后，吸弃6孔板中培养基，预冷PBS洗涤2次，每孔加入120 μl RIPA裂解液置于冰上充分裂解30 min，4 ℃、14 000 r/min离心15 min，取上清液至预冷离心管中，按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书步骤对各组样品进行定量检测，加入适量蛋白上样缓冲液后100 ℃加热5 min变性。取20 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，再将蛋白转移到PVDF膜，用5%BSA室温封闭1 h，洗膜后分别加入TLR4一抗(1 ∶1 000)、HIF-1α一抗(1 ∶1 000)、TNF-α一抗(1 ∶1 000)、IL-6一抗(1 ∶1 000)、β-actin一抗(1 ∶5 000) 4 ℃孵育过夜，次日TBST漂洗PVDF膜3次，5 min/次，加入二抗(1 ∶20 000)室温摇床孵育2 h，TBST漂洗3次，5 min/次。暗室ECL显影获取图片，用ImageJ软件分析出各组蛋白与内参的灰度值，得出各组蛋白与内参的灰度比值，反映出各组蛋白的相对表达水平。

1.2.8Gly-LDL干预下沉默TLR4、HIF-1α后TLR4、HIF-1α蛋白表达水平 在6孔板中接种3～5代细胞，每孔细胞数约为2×105个，在恒温培养箱中培养细胞生长至80%左右开始后续实验。转染前将培养基换成不含血清和双抗的培养基，以免影响转染效率。分别设为对照组、模型组(Gly-LDL 100 mg/L)、si-TLR4组(Gly-LDL 100 mg/L+si-TLR4)、TLR4空载组(Gly-LDL 100 mg/L+si-NC1)、si-HIF-1α组(Gly-LDL 100 mg/L+si-HIF-1α)和HIF-1α空载组(Gly-LDL 100 mg/L+si-NC2)。提前将si-TLR4、si-NCl、si-HIF-1α、si-NC2冻干粉用原装DEPC水进行溶解，取siRNA，用opti-MEM培养基稀释siRNA，终浓度为10 μmol/L，总体积为250 μl，静置5 min；
同时取2 μl Lipofectamine 2000与248 μl opti-MEM培养基混匀，静置5 min。将上述两种液体混合，静置20 min。每孔先加入1 500 μl opti-MEM培养基，20 min之后将500 μl混合液加入6孔板中。6 h后将opti-MEM更换为完全培养基，继续培养48 h，后续根据实验需要进行下一步操作。实验重复3次。小干扰序列见表2。

表2 小干扰序列

2.1 Gly-LDL对HUVECs增殖活力的影响不同浓度Gly-LDL处理内皮细胞，在24 h检测细胞增殖活力的改变，CCK-8法检测结果显示：细胞活力差异有统计学意义(F=69.96,P<0.001)，与对照组OD值(1.09±0.10)相比，n-LDL组OD值(0.96±0.03)显示对HUVECs增殖活力无影响，差异无统计学意义(P>0.05)；
而Gly-LDL(50、75、100 mg/L)组OD值分别为(0.70±0.03)、 (0.59±0.02)、 (0.53±0.03)，与对照组相比，细胞存活率分别下降36.16%、45.77%、51.24%，呈剂量依赖性(P<0.01)；
与n-LDL组相比，Gly-LDL 50 mg/L组细胞存活率下降27.08%(P<0.001)。

2.2 Gly-LDL对HUVECs迁移能力的影响不同浓度Gly-LDL处理HUVECs，在12 h检测细胞迁移能力的改变，细胞划痕实验结果(图1)显示：细胞迁移能力差异有统计学意义(F=139.85,P<0.001)，与对照组愈合率(52.03±1.79)相比，n-LDL组愈合率(48.55±1.93)显示对细胞迁移能力无影响，差异无统计学意义(P>0.05)；
而Gly-LDL(50、75、100 mg/L)组愈合率分别为(35.88±2.40)、(22.68±3.10)、(17.65±1.59)，与对照组相比，细胞迁移率分别下降31.04%、56.40%、66.08%，呈剂量依赖性(P<0.001)；
与n-LDL组相比，Gly-LDL 50 mg/L组细胞迁移率下降26.10%(P<0.01)。

图1 细胞划痕实验检测不同浓度Gly-LDL对HUVECs迁移能力的影响 ×100

2.3 Gly-LDL对HUVECs细胞因子表达的影响ELISA法检测TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1分泌水平，结果(表3)显示：各组TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1分泌量差异有统计学意义(F=333.80、68.91、127.07、79.56，P<0.001)，与对照组相比， n-LDL组TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与对照组相比，Gly-LDL(50、75、100 mg/L)组TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)；
与n-LDL组相比，Gly-LDL 50 mg/L组中TNF-α、IL-6、 ICAM-1、VCAM-1分泌水平增高，其中TNF-α、IL-6、ICAM-1分泌水平差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 Gly-LDL对HUVECs细胞因子表达的影响

2.4 Gly-LDL对HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响不同浓度Gly-LDL处理细胞24 h后，qRT-PCR结果(图2)显示：各组TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达量差异有统计学意义(F=174.35、275.06、126.54、109.70，P<0.05),与对照组相比，n-LDL组和Gly-LDL(50、75、100 mg/L)组诱导的HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与n-LDL组相比，Gly-LDL(75、100 mg/L)组中TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA水平增高，差异有统计学意义，并呈剂量依赖性(P<0.05)。

图2 Gly-LDL对HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6 mRNA表达的影响A：对照组；
B：n-LDL组；
C：Gly-LDL 50 mg/L组；
D：Gly-LDL 75 mg/L组；
E：Gly-LDL 100 mg/L组；
与对照组比较：*P<0.05；
与n-LDL组比较：#P<0.05

2.5 Gly-LDL对HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表达的影响不同浓度Gly-LDL处理细胞24 h后，Western blot检测炎症蛋白TLR4，HIF-1α、IL-6、TNF-α水平，结果(图3)显示：各组TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白表达量差异有统计学意义(F=47.63、42.80、78.25、21.13，P<0.001)，与对照组相比，n-LDL组中TLR4、TNF-α蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)；
与对照组相比，Gly-LDL 50 mg/L 组中HIF-1α、TNF-α蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，Gly-LDL 75、100 mg/L组中TLR4、HIF-1α、TNF-α、IL-6蛋白水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 Gly-LDL对TLR4/HIF-1α信号通路相关蛋白的影响A：对照组；
B：n-LDL组；
C：Gly-LDL 50 mg/L组；
D：Gly-LDL 75 mg/L组；
E：Gly-LDL 100 mg/L组；
与对照组比较：*P<0.05；
与n-LDL组比较：#P<0.05

2.6 检测HUVECs中沉默TLR4、HIF-1α蛋白效率分别用si-TLR4、si-HIF-1α转染HUVECs，Western blot结果(图4)显示：与si-NC组相比，si-TLR4组中TLR4蛋白表达下调44.18%，差异有统计学意义(P<0.001)；
与si-NC组相比，si-HIF-1α组中HIF-1α蛋白表达下调69.10%，差异有统计学意义(P<0.001)。

图4 si-TLR4和si-HIF-1α对HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白沉默的影响A：沉默TLR4效率检验；
B：TLR4蛋白统计分析图；
C：沉默HIF-1α效率检验；
D：HIF-1α蛋白统计分析图；
与si-NC组比较：***P<0.001

2.7 Gly-LDL干预下沉默TLR4、HIF-1α后对HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白表达的影响分别用si-TLR4、si-HIF-1α转染HUVECs后，按照实验分组加入100 mg/L Gly-LDL干预24 h，结果(图5)显示：与对照组相比，模型组中TLR4、HIF-1α蛋白表达均升高(P<0.05)；
与模型组相比，si-TLR4组中TLR4、HIF-1α蛋白表达均降低(P<0.05)；
与模型组相比，si-HIF-1α组中HIF-1α蛋白表达降低(P<0.05)，TLR4蛋白表达差异无统计学意义；
与对照组相比，si-HIF-1α组中TLR4蛋白升高(P<0.05)。

图5 沉默TLR4、HIF-1α对HUVECs中TLR4、HIF-1α蛋白表达的影响A：对照组；
B：模型组；
C：si-TLR4组；
D：TLR4空载组；
E：si-HIF-1α组；
F：HIF-1α空载组；
与对照组比较：*P<0.05；
与模型组比较：#P<0.05

糖尿病是一种以糖代谢紊乱为主的临床综合征，糖尿病大血管并发症是糖尿病患者致残致死主要原因[6]，血管内皮损伤是导致糖尿病大血管并发症的关键因素[7-8]。因此，血管内皮损伤是防治糖尿病大血管病变的重要关注点。目前认为，血管内皮损伤的出现，在于糖尿病高血糖时，体内各种蛋白非酶促糖基化反应增强。而晚期糖基化蛋白终末产物(advanced glycated end products，AGEs)可损害内皮细胞的形态及其功能，从而诱发糖尿病血管病变[9-10]。Gly-LDL是AGEs中最主要成分之一，但目前Gly-LDL与糖尿病血管内皮损伤的关系仅停留在相关性研究中。本研究用Gly-LDL(50、75、100 mg/L)处理HUVECs 24 h，存活率降低36.16%、45.77%和51.24%；
迁移率降低31.04%、56.40%和66.08%；
并促进TNF-α、IL-6、ICAM-1、VCAM-1细胞因子分泌，表明Gly-LDL能够降低细胞生存率和迁移能力，促进炎症因子释放，并呈浓度依赖性。

大量研究[11-12]显示糖尿病血管内皮损伤与TLR4信号激活有关。在血管内皮病变患者外周血中，巨噬细胞表现为TLR4信号过度激活，使机体处于高度促炎状态[13]。TLR4参与糖尿病病理生理过程，TLR4能够调节NADPH氧化酶活性，导致体内活性氧增加，加速糖尿病大血管并发症发展[14]；
在糖尿病血管内皮损伤中，树突状细胞通过RAGE-TLR4-PKCβ1信号通路介导慢性炎症反应[15]；
高迁移率组蛋白(high mobility group protein B1,HMGB1)在糖尿病发生过程中通过TLR4/eNOS通路参与内皮依赖性舒张功能损伤[16]。为了验证Gly-LDL是否通过TLR4信号通路介导血管内皮炎症反应，本研究选用HUVECs作为研究对象，结果显示Gly-LDL能提高HUVECs中TLR4、HIF-1α、TNF-α和IL-6 mRNA和蛋白水平，表明Gly-LDL能够激活TLR4信号通路，促进炎症因子TNF-α和IL-6的表达，介导血管内皮细胞损伤。但是Gly-LDL通过TLR4信号如何调控炎症反应，是目前尚未解决的科学问题。研究[17]表明TLR4信号能够调控HIF-1α影响TNF-α、IL-1β分泌，HIF-1α是人和哺乳动物中关键核转录因子，常氧状态下HIF-1α的脯氨酰胺基和门冬酰胺基发生羟基化，与E3泛素化连接酶结合，VHL蛋白能募集泛素连接酶，与泛素化连接酶结合的HIF-1α被蛋白酶体降解；
低氧状态下，HIF-1α羟基化被抑制，与HIF-1β结合，在细胞核内与缺氧反应元件结合，激活靶基因转录[18]。HIF-1α能够调节血管内皮生长因子和葡萄糖转运蛋白1表达，并且涉及炎症反应[19]。为了验证TLR4能否调控HIF-1α表达，在Gly-LDL干预下沉默TLR4、HIF-1α基因，结果显示：Gly-LDL能够上调TLR4和HIF-1α蛋白水平，表明两者可能存在协同作用；
沉默TLR4基因后，TLR4和HIF-1α蛋白表达下调，而沉默HIF-1α基因后，只有HIF-1α蛋白表达下调，而TLR4蛋白在Gly-LDL干预下仍是上调，因此推测，Gly-LDL上调TLR4信号，激活HIF-1α表达介导HUVECs炎症反应。

综上所述，本研究结果显示：Gly-LDL能够上调TLR4信号，激活HIF-1α的表达介导炎症因子释放，降低HUVECs生存率和迁移能力，诱导HUVECs损伤。Gly-LDL水平有望成为衡量糖尿病血管内皮损伤指标之一，并为糖尿病血管内皮损伤临床治疗提供新的潜在靶点。

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