栀子全基因组SSR标记开发及遗传多样性分析
时间：2022-11-15 08:55:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
刘春雷，胡开治，刘燕琴，曹敏，唐祥友，陈艾萌
1.重庆市药物种植研究所，特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，重庆 408435；
2.四川省内江市农业科学院，四川 内江 641000
栀子Ellis为茜草科栀子属常绿灌木，以干燥成熟果实入药，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效，主产于江西、浙江、四川、重庆、福建、湖南等地。栀子果实富含栀子苷、西红花苷等成分，具有保肝利胆、抗炎、保护心脑血管系统等作用，不仅是许多药品的原料药，还可从中提取黄色素，作为天然的食品着色剂，具有巨大的药用及经济价值。随着市场需求的不断增加，各地开始无序发展，引种混乱，导致其亲缘关系十分复杂。遗传育种工作的核心是创造、重组遗传变异，因此育种工作的成效取决于种质遗传变异的水平，关于栀子种质资源的遗传多样性分析已有报道，但由于各研究者选用的栀子群体有所差别或种类不全，其种间、种内显示的多态性并不完全一致，分析结果存在一定矛盾。同时由于缺乏基因组数据，稳定、可靠的分子标记较少，极大限制了栀子遗传育种的研究。
SSR（simple sequence repeats）也称微卫星DNA，是以少数几个核苷酸（1～6个）为单位重复、总长度数十碱基对的串联重复序列。与其他分子标记相比，SSR具有分布均匀、特异性高、多态性信息含量丰富等特点，而且呈共显性遗传，符合孟德尔遗传定律，已广泛用于遗传图谱构建、分子标记辅助育种、种质资源鉴定等方面。目前有关栀子SSR标记的开发国内外报道非常有限，Xu等利用文库富集法开发了22对多态性SSR引物，Deng等利用转录组序列开发25对具有多态性的SSR引物，还有一些学者也利用转录组序列进行了SSR分析，但没有进行验证。本研究以课题组完成的栀子基因组序列为基础，采用生物信息学方法开发SSR引物，并对不同居群栀子的遗传多样性水平及种群结构进行分析评价，以期为栀子资源开发利用和分子辅助育种提供参考和依据。
C1000 TouchPCR仪（美国伯乐公司），DYCZ-30Z垂直电泳仪（北京六一生物科技有限公司），Power B3000电源（美国伯乐公司），Thermo Scientific Pico 21离心机（赛默飞世尔科技有限公司），NanoDropOne超微量紫外分光光度计（赛默飞世尔科技有限公司）。
植物基因组DNA快速提取试剂盒（货号DE221-50T）、2×Taq Master Mix（货号SL2610）、琼脂糖（货号CA1341），北京酷来搏科技有限公司；
聚丙烯酰胺凝胶制备试剂盒（货号P1340-50T），北京索莱宝科技有限公司。供试栀子材料采自重庆、贵州、四川、江西、浙江、福建6个居群，共57份栀子个体样本，各样本间隔10 km以上，统一种植于重庆市南川区三泉镇重庆市药物种植研究所栀子种质圃内，经重庆市药物种植研究所刘正宇研究员鉴定为茜草科植物栀子Ellis，详见表1。选取幼嫩的栀子叶片，采用改良的CTAB法进行栀子基因组DNA的提取，通过超微量紫外分光光度计及1%琼脂糖电泳检测DNA的浓度和质量，并稀释至50 ng/μL，置-20℃冰箱保存，备用。
表1 57份栀子样本信息
2.1 栀子基因组SSR位点鉴定与分析
采用MISA程序（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）对项目组测序组装完成的染色体水平的栀子全基因组序列（GenBank：GCA_013103745.1）搜索SSR位点，标准为：核苷酸重复（MNRs，P1）、二核苷酸重复（DNRs，P2）、三核苷酸重复（TNRs，P3）、四核苷酸重复（TTRs，P4）、五核苷酸重复（PNRs，P5）及六核苷酸重复（HNRs，P6），重复单元分别大于10、7、6、5、4、4次重复；
距离100 bp以上的视为一个SSR位点。
栀子SSR在基因组不同区域的分布见表2。从栀子基因组序列中共搜索到232880个SSR位点，栀子基因组全长为534975 817 bp，平均间隔2.3 kb就有1个SSR位点，其SSR位点序列的平均长度为22.69 bp，GC含量平均为11.29%。其中83.02%的SSR位点分布于参考基因组的基因间区域，其SSR序列的平均长度最长（22.95 bp），16.5%的SSR分布于内含子区域，而位于外显子区域的SSR位点仅有1122个，占0.48%，但其GC含量最高（39.81%）。
表2 栀子SSR在基因组不同区域的分布
2.2 不同类型SSR位点特征
对不同类型SSR位点特征进行分析，结果见表3。Perfect SSRs（P型）的数量为200551，占SSR总数的86.12%，是Compound SSR（复合型）数量的6.2倍。在6种P型SSR中，随着重复单元长度增加，SSR位点检出数逐渐减少，其中MNRs的数量最多，占SSR总数的64.60%，而HNRs仅搜索到1209个，前3位MNRs、DNRs和TNRs总计188994个，占SSR总数的81.15%，说明这3种类型在栀子SSR中占主导地位。
表3 栀子不同类型SSR位点的特征
对不同类型SSR位点长度的分析结果显示，P型SSR位点的长度介于10～111 bp，平均长度为14.3 bp，其中HNRs的平均长度为25.83 bp，显著大于其余5种P型SSR，MNRs的平均长度最短，仅为12.55 bp。复合型SSR位点的长度介于20～817 bp，平均长度为74.72 bp。就GC含量 而 言，HNRs的GC含量最 高（32.46%），其次是DNRs，MNRs的平均GC含量最低仅为2.56%；
复合型SSR的平均GC含量为25.34%，高于P型SSR（9.03%）。
2.3 栀子SSR位点基序分析
从栀子基因组SSR位点的基序组成来看，单核苷酸至六核苷酸重复基序类型依次有2、4、10、31、62、195种。对MNRs、DNRs、TNRs 3种类型SSR进一步分析，结果见表4。MNRs中基序类型以A/T为主，占总SSR的62.94%；
在DNRs型中，（AG/CT）n基序最为丰富，占总SSR位点的4.94%，其次是（AT/TA）n；
TNRs型所有10种预期的重复基序均被检测到，其中（AAT/ATT）n的数量最多，有3669个，占总SSR位点的1.58%，其 次 为（AAG/CTT）n。此 外TTRs、PNRs、HNRs中出现频率最高的基序类型分别为（AAAT/ATTT）n、（AAAAG/CTTTT）n和（AAAAAG/CTTTTT）n。
表4 栀子SSR位点的基序组成
2.4 引物设计及筛选
编写Perl程序提取SSR位点上下游各120 bp的侧翼序列，采用Primer3.0引物设计软件设计引物，设计的参数为：引物长度18～26 bp，退火温度56～64℃，GC含量40%～60%。为获得与基因功能相关的SSR标记，在排除复合型SSR位点的基础上，选择位于外显子区域且具有明确注释信息的80对SSR引物，作为扩增候选引物。
对3份性状差别较大的栀子样品进行SSR-PCR扩增，反应体系为20 μL（Mix Taq DNA聚合酶10 μL，10 pmol/μL引物（F+R）1.6 μL，50 ng/μL DNA模板0.6 μL，用ddHO补齐）。反应程序为：94℃模板预变性5 min；
94℃变性45 s，53～60℃退火30 s，72℃延伸45 s，35个循环；
最后72℃延伸5 min，退火温度随引物而变化。扩增产物置-20℃冰箱保存备用，采用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物。其中68对引物扩增成功，占总数的85%。根据条带清晰、多态性好的原则，进一步筛选出9对引物，对供试栀子样品进行SSR-PCR扩增。57份栀子样品共检测到64条扩增条带，其中多态性条带62条，产物长度为110～300 bp，除引物GD60的多态性比率为71.4%外，其余引物的多态性比率均为100%。见图1、表5。
图1 引物GD58在部分供试栀子样品的扩增结果
表5 开发的栀子SSR引物序列
2.5 遗传多样性分析
对PCR扩增结果，根据分子量从大到小依次记作A、B、C、D……，1条为纯合，2条为杂合，分别记为AA、AB、BB、AC等，以此类推，进行条带统计。采用POPGENE1.32软件计算遗传多样性参数，包括等位基因数（）、有效等位基因数（）、Nei’s基因多样性指数（）、Shannon’s信息指数（）、多态位点百分率（PPB）、居群总遗传多样性（）、居群内遗传多样性（）、Nei’s基因分化系数（）、基因流（）。
利用PopGene1.31软件对6个居群的栀子样品进行遗传多样性分析，结果见表6。栀子物种水平的a、e、、、PPB分别为1.968、1.397、0.251、0.397、96.77%，反映出栀子物种水平具有较高的遗传多样性。6个栀子居群的为1.548～1.871，平均1.696；
为1.283～1.404；
为0.170～0.247；
为0.261～0.384；
PPB为54.84%～87.10%，各项遗传多样性指标均以江西居群最高，其次为重庆居群，浙江居群最低。
表6 栀子居群遗传多样性
为0.246，为0.210，为0.146，为2.923，表明居群间存在一定的基因流动，其遗传变异主要发生在居群内个体间（85.4%），14.6%的遗传变异来自居群间。
2.6 聚类分析
根据Nei’s遗传距离，采用R软件ape程序包，对供试栀子居群进行UPGMA聚类分析，结果显示6个栀子居群被划分为2大类，其中重庆、贵州、四川居群聚为一类，福建、浙江、江西居群聚为另一类，其分类具有较强的地域性（见图2A）。进一步对供试栀子个体样本进行聚类分析，结果表明，可在遗传距离为0.44处，将57份栀子样本划分为4大类，其中CQ02、CQ04划分为B1类，JX03、JX05、JX07、JX08、JX09划分为B2类，SC01、CQ01、CQ12划分为B3类，剩余47个栀子样本聚为B4类。B1、B2、B3类中包含的栀子样本数较少，但均单独聚为一类，说明其组内个体间具有较近的亲缘关系，而与其他栀子种质遗传距离较远（见图2B）。
图2 栀子居群及57个栀子样品UPGMA聚类分析
利用全基因组序列大规模开发SSR标记，在各种基因组已测序的物种中得到广泛应用。由于前期尚缺乏基因组序列，关于栀子分子标记的研究进展相对滞后。本研究基于课题组测序组装获得的栀子全基因组序列，利用MISA软件共扫描鉴定到232880个SSR位点，平均每2.3 kb存在1个SSR位点，其数量和密度远高于从转录组序列中搜索到的结果及咖啡。由于外显子为基因编码序列，具有较高的保守性，因此SSR位点主要分布于内含子、UTR及基因间等区域，栀子基因组中的SSR位点的分布频率也具有相同规律，各区域SSR位点所占比例为：基因间＞内含子＞外显子。就SSR位点的平均长度而言，栀子SSR的平均长度为22.69 bp，高于水稻、玉米、马铃薯等。在GC含量方面，物种不同，其SSR的GC含量差异较大，同为单子叶植物的玉米SSR位点的GC含量（46.71%）远高于水稻（27.7%），两者在外显子区域的GC含量均最高，为80%左右，栀子SSR位点的平均GC含量仅为11.29%，外显子区域最高为39.81%，均远低于水稻、玉米，与咖啡相似。
栀子基因组中的SSR数量丰富，但不同核苷酸类型SSR的数量差异较大。栀子基因组中单核苷酸型SSR的数量最多，占64.6%，6种完全型SSR随着重复单元长度的增加，其检出数越少，与转录组分析的结果一致，而咖啡的二～六核苷酸类型的SSR中，以四核苷酸类型最为丰富。栀子与咖啡的SSR位点基序频率也存在一定差异，如在栀子四核苷酸重复基序中（AAAT/ATTT）n最为丰富，而咖啡（AAAT/ATTT）n数量最多；
在栀子五核苷酸重复基序中（AAAAG/CTTTT）n最丰富，而咖啡（AAAAT/ATTTT）n数量最多；
在栀子六核苷酸重复基序中（AAAAAG/CTTTTT）n最为丰富，咖啡（AAAAAT/ATTTTT）n出现最多，表明物种间SSR位点的基序频率普遍存在显著差异。同时栀子不同类型SSR的优势基元均是以A/T基序为主，从而解释了前述栀子SSR位点GC含量较低的原因。
分子标记的多态性是评价SSR标记可用价值的重要指标。本研究从外显子区域随机选取了80对具有明确注释信息的SSR引物，采用3份栀子材料进行引物筛选，其中85%的引物能够扩增出清晰的条带，最后仅筛选出9对多态性较好的引物，低于Deng等的开发效率，可能由于筛选的材料较少，遗传差异不足而淘汰了部分具有利用价值的SSR标记。
遗传多样性是生物所携带遗传的信息的总和，是评价生物多样性的重要部分。已有研究采用多种分子标记对不同栀子群体进行评价，均表明栀子种群具有丰富的遗传多样性。本研究对6个栀子居群进行分析，结果表明物种水平为0.251，为0.397，PPB为96.77%，均反映出栀子物种水平的遗传多样性较高，但不同居群的遗传多样性水平差别较大。姜武等研究显示浙产栀子居群的遗传多样性水平高于西南居群，本研究结果却显示江西居群的遗传多样性最高，其次为重庆居群，而浙江居群最低，可能由于样本量及采样范围有所差别。通过群体分析发现，栀子居群间存在一定的基因流动（=2.923），其遗传变异主要发生在居群内个体间，少部分来自于居群间（=0.146），与前人研究结果一致。居群聚类分析结果显示，地理位置靠近的重庆、贵州、四川居群聚为一类，福建、浙江、江西居群聚为另一类，进一步对供试栀子个体样本聚类分析结果显示，部分不同产区的栀子个体也聚在同一子类中，说明不同产区栀子的遗传分化具有较强的地域性，同时存产区间的相互引种交流，其亲缘关系十分复杂。
综上所述，本研究对栀子全基因组序列中的SSR位点进行分析，并设计开发了一批SSR引物，进一步对6个栀子居群进行了遗传多样性分析，其引物呈现较高的多态性，丰富了栀子SSR标记库，可为栀子种质资源的鉴定和开发利用奠定基础。
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