脱氧核糖核酸-蛋白质相互作用产物的检测及其在胃癌组织中的应用_脱氧核糖核酸水解产物

　　摘 要 建立了无胶筛分毛细管电泳�激光诱导荧光（Non�gel sieving capillary electrophoresis with laser induced fluorescence, NGS�CE�LIF）检测脱氧核糖核酸（DNA）�蛋白质相互作用产物的方法。考察了筛分介质聚环氧乙烷（Poly （ethylene oxide），PEO）浓度、分离温度、分离电压及缓冲液三羟甲基氨基甲烷硼酸 （Tris�Borate�EDTA，TBE）pH值等条件对pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker和Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S相互作用产物的影响。结果表明，当PEO浓度为0.1%，TBE的pH 为9.0，分离电压为15 kV，分离柱温15 ℃时，DNA�蛋白质相互作用产物得到有效分离。本方法应用于人胃癌组织p53基因扩增后的PCR产物和从相应组织中提取的蛋白质二者相互作用产物时，检测效率高，分离效果好。
　　关键词 脱氧核糖核酸； 蛋白质； 相互作用； 无胶筛分毛细管电泳； 激光诱导荧光检测； 聚环氧乙烷； 胃癌组织�
　　1 引 言�
　　蛋白质和核酸是构成生命体最为重要的两类生物大分子，脱氧核糖核酸（DNA）�蛋白质相互作用的研究是21世纪生命科学研究的主要课题之一，涉及多学科前沿交叉领域的相关知识和技术方法。过去的研究主要集中在宏观认识方面，近年来，研究者综合各种手段并采用先进的仪器在微观上取得一些可喜的成果��[1,2]�，但目前仍处于探索阶段。弄清DNA�蛋白质相互作用的机制，对于了解DNA转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有极其重要的指导作用。�
　　采用无胶筛分毛细管电泳（Non�Gel sieving capillary electrophoresis，NGS�CE）分析核酸和蛋白质已有报道��[3,4]�，但将其用于DNA�蛋白质相互作用的研究较少。研究分子间相互作用是毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）的一个重要应用领域��[5～8]�，对于一个相互作用体系，只要游离配体（或受体）和结合物之间存在荷质比的差异，理论上讲，都可以在电场下将它们分离，而实际的分离效果则取决于CE的模式、电场强度、温度、毛细管的内壁状况等因素。在CE研究分子间相互作用中，最常用的检测手段是紫外和激光诱导荧光（Laser induced fluorescence，LIF），激光诱导荧光通常要比紫外检测的灵敏度高出10～1000倍，并且CE信号干扰低，但需要进行荧光标记。研究DNA�蛋白质相互作用的荧光法，主要是将荧光物质修饰到蛋白质或核酸分子上构成新型荧光标记物质并结合相关仪器而改造成新型的检测技术，此法对待测物质的浓度要求低，灵敏度高且部分荧光技术可实现对待测物质的动态分析等。Wan等��[9]�利用毛细管电泳激光诱导荧光（Capillary electrophoresis with laser induced fluorescence，CE�LIF）技术研究了单链DNA结合蛋白质的反应，CE�LIF结果显示不同核苷酸标记的荧光探针因与蛋白质结合的强弱不同，使得DNA�蛋白质复合物的计量系数不同，从而得以区分。�
　　SYBR Green I和异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC）是两种常用的荧光衍生试剂，前者常用于核酸的标记，后者则用于对蛋白质的标记。本实验分别以二者为柱前衍生试剂， PEO为筛分介质��[10]�， 1×TBE为电泳缓冲溶液，对DNA和蛋白质进行NGS�CE分析。以SYBR Green I标记DNA标准物（pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker（26～501 bp））和蛋白质标准物（Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S（6.5～200 kDa））共同孵育后的混合物，以DNA和蛋白质标准物为材料，对DNA�蛋白质相互作用产物的方法学及实验条件进行考察，将其用于提取的胃癌组织基因和蛋白质相互作用产物的检测，探讨DNA�蛋白质相互作用的机制，并以DNA为“诱饵”，得到一种检测蛋白质的方便、有效、快速的方法。
　　2 实验部分 �
　　2.1 仪器与试剂�
　　P/ACE System 5000型毛细管电泳仪（美国Beckman公司），激光检测器波长为488 nm ；石英毛细管柱（河北永年光导纤维厂）； P��H�S�3C型酸度计（上海雷磁仪器厂）；AE240型电子天平（Mettler，瑞士）；磁力搅拌器（深圳天南海北实业有限公司）。�
　　聚环氧乙烷 （PEO，M�w＝300000）；�γ��甲基丙烯酰基�三（甲氧基）硅烷（MAPS，A Johson Matthey公司）；三羟甲基氨基甲烷（Tris，上海山浦化工有限公司）；硼酸（Boric acid）、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）（天津化学试剂厂）；与氩离子激光器（�λ���ex�＝488 nm，�λ���em�＝520 nm） 匹配的荧光试剂SYBR Green I 和FITC分别购自厦门百维信公司和北京鼎国生物技术有限责任公司；Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S（TaKaRa）\,pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker、PCR反应试剂、动物组织基因组提取试剂盒、UNIQ�10柱式PCR产物纯化试剂盒和蛋白质提取非变性裂解液试剂盒均购自上海生物工程技术有限公司。实验所用试剂均为分析纯。�
　　胃癌组织标本取自兰州军区兰州总医院病理科，标本均经胃部切除并经病理切片证实。�
　　2.2 组织DNA的提取、目的基因的扩增及标记�
　　利用动物组织基因组提取试剂盒提取胃癌组织基因组DNA，PP5.0软件设计p53基因包含282位密码子突变位点的引物，引物由上海生物工程技术有限公司合成。上游引物：5′�TCACTGAGTTCGCCAAGAGCAT�3′；下游引物：5′�ATCACTGAAGGGTTTGCGGAGG�3′。PCR扩增反应体系25
　　�SymbolmA@ L中含dNTP 200
　　�SymbolmA@ mol/L、TaqDNA 聚合酶0.5 U/
　　�SymbolmA@ L、引物0. 05
　　�SymbolmA@ mol/L、DNA 模板20 mg/L。PCR扩增条件：�94 ℃变性30 s�，59.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测。�
　　以SYBR Green I对DNA标准物和胃癌组织p53基因PCR产物进行标记，SYBR Green I:DNA＝�1∶5�，室温避光标记30 min，取标记混合物进行CE检测。�
　　2.3 蛋白质的提取及标记�
　　取胃癌组织10～50 mg，充分剪碎，置于Epdoff管中，利用动物组织蛋白质提取试剂盒提取胃癌组织蛋白质，在－40 ℃冰箱保存备用。�
　　用FITC对蛋白质标准物和胃癌组织蛋白质进行标记，FITC:蛋白质＝1∶100，室温避光标记4 h，取标记混合物进行CE检测。�
　　2.4 DNA和蛋白质的共同孵育及标记�
　　
　　取适量DNA和蛋白质标准物，在pH 9缓冲溶液中37 ℃共同孵育4 h，然后加入SYBR Green I标记，30 min后，对标记混合液进行CE检测。胃癌组织样品采用相同的方法进行处理。�
　　2.5 毛细管电泳检测�
　　
　　为了抑制电渗流并减少毛细管内壁对分离物的吸附，提高迁移时间的重现性，对毛细管柱内壁进行涂层修饰��[11]�。涂层毛细管柱长37 cm×75
　　�SymbolmA@ m，有效长度27 cm，使用前以水和1×TBE分别冲洗5 min，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质PEO溶液，以1×TBE为缓冲液进行毛细管电泳LIF检测（�λ���ex�＝488 nm，�λ���em�＝520 nm），10 s负极电动进样，进样电压10 kV，P/ACE System station数据处理软件采集数据。�
　　CE分离pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker的最佳条件同文献[12]: 3.0% PEO，1×TBE（�pH 8.3�），电压15 kV，温度15 ℃；CE分离Protein Molecular Weight （Broad） D532S的最佳条件同文献[13]：PEO的浓度0.05%，电泳温度15 ℃，分离电压15 kV和缓冲液pH值10.0；CE分离DNA、蛋白质和二者结合物时所用1×TBE缓冲液的pH分别为8.3，10.0和9.0，缓冲液的组成为�89 mmol/L� Tris, �89 mmol/L硼酸和2 mmol/L EDTA�。�
　　取适量已标记好的DNA�蛋白质相互作用的混合物进行CE检测，考察二者相互作用产物分离的最佳条件。
　　3 结果与讨论�
　　3.1 DNA标准物和蛋白质标准物的CE检测结果�
　　3.1.1 DNA标准物的CE检测 利用CE分离pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA 标准物，由图1可见，背景信号低，分离效果好，分离时间短，电泳在13 min内完成，所有DNA片段均得到基线分离。�
　　
　　3.1.2 蛋白质标准物的CE检测 CE分离Protein Molecular Weight （Broad） D532S的结果见图2，蛋白质标准物在最佳检测条件下，13 min内完成电泳分离过程。由于FITC作荧光标记物分离蛋白质时，在碱性条件下荧光较强，杂峰干扰减少，因而不同分子质量的蛋白都得到基线分离。�
　　[TS（] 图1 毛细管电泳分离pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA 标准物�
　　Fig．1 Electropherograms of pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker separation by CE�
　　1～11: 26, 34, 67, 110�111, 147, 190, 242, 331, 404, 489, 501 bp．[TS）]
　　[TS（] 图2 毛细管电泳分离蛋白质分子量标准物 （Broad） D532S�
　　Fig．2 Capillary electrophoresis traces of protein molecular weight marker （Broad） D532S�
　　1～9: 6.5, 14.3, 20.1, 29.0, 44.3, 66.4, 97.2, 116, 200 kDa.[TS）]
　　3.2 DNA标准物和蛋白质标准物相互作用产物的CE条件优化�
　　3.2.1 PEO浓度对分离的影响 水溶性聚合物PEO溶液可以吸附到毛细管内壁上形成一层能降低电渗流，且具有筛分功能的动态涂层��[14]�。将PEO固体溶于TBE中，配制成一系列浓度分别为0.05%，�0.1%�，0.2%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%的筛分介质，在分离电压15 kV，温度15 ℃，pH＝9.0时，考察不同浓度PEO对DNA�蛋白质标准物相互作用物的分离效果（图3）。较低浓度的PEO不具有筛分效果，PEO浓度为0.05%时，样品不能有效分离；PEO浓度为0.1%时，产生了筛分效应较好的分离效果；此后增加PEO浓度，筛孔缩小，位阻效应增强，迁移时间延长，DNA�蛋白质相互作用产物的分离效果变差。因此选择0.1% PEO作为筛分介质研究DNA�蛋白质之间的相互作用产物。�[TS（] 图3 不同浓度PEO分离DNA�蛋白质标准物相互作用产物的电泳图�
　　Fig．3 Capillary electrophoresis traces of DNA�Protein Marker �interaction� products separation under different poly （ethylene �oxide�）（PEO）concentration （a. 0.05%； b. 0.1%； c. 1.5%； d. 3.0%）[TS）]
　　
　　
　　3.2.2 温度对分离的影响 温度是影响缓冲液粘度的主要因素。通常温度越高，迁移时间越短，分离度下降，柱效降低。温度可影[TS（] 图4 不同温度时分离DNA�蛋白质标准物相互作用产物的电泳图�
　　Fig．4 Capillary electrophoresis traces of DNA�protein marker �interaction� products separation at different temperatures�
　　a. 15 ℃； b. 20 ℃．[TS）]响缓冲液的pH值，进而间接影响蛋白质所带电荷，缓冲液TBE对温度变化比较敏感，而且温度的改变可能会改变蛋白质的空间结构，影响DNA�蛋白质相互作用产物的分离。当温度为15 ℃时，电泳呈现多个峰（图4），能更全面反映二者的相互作用本质，但温度继续升高时，电泳峰数目减少，分离时间缩短。温度过高会导致较大电流波动，确定适宜分离温度为15 ℃。�
　　
　　3.2.3 电压对分离的影响 电压主要影响分离的效率及效果，低电压时分离时间较长，峰高较低。随着电压的增加，各组分的迁移时间缩短，样品峰高随之增加，但继续提高电压，可因电压过高致使电流过大，个别峰不能分离，分离效果变差（图5）。综合考虑迁移时间及分离效果，最佳分离电压选择为15 kV。�
　　
　　[TS（] 图5 不同电压下毛细管电泳分离DNA�蛋白质标准物相互作用产物的电泳图�
　　Fig．5 Capillary electrophoresis traces of DNA�Protein Marker interaction products separation under different voltage�
　　（a. 10 kV； b. 15 kV； c. 20 kV； d. 25 kV）．[TS）]
　　
　　3.2.4 pH值对分离的影响 缓冲液的pH值是影响CE分离效果的主要因素，它决定电泳过程运行的稳定状况以及被分离物的稳定性。配制pH值分别为6.0～10.0的TBE缓冲溶液，对影响DNA�蛋白质相互作用物分离效果的pH值进行了优化。当pH＝10.0时，DNA和蛋白质分别能被最佳分离的8.3和，DNA�蛋白质相互作用物不能得到分离；当模拟人体生理条件（pH 7.5）分离二者时，出现4个样品峰，但不能达到基线分离。实验选择缓冲液最佳pH值为9.0（图6），分离效果较好。�
　　
　　[TS（] 图6 不同pH值TBE分离DNA�蛋白质标准物相互作用产物电泳图�
　　Fig．6 Capillary electrophoresis traces of DNA�Protein Marker interaction products under different pH of �tris�Borate�EDTA� (TBE) buffer�
　　a. 7.5； b. 8.3； c. 9.0； d. 10.0．[TS）]
　　3.3 样品分析�
　　3.3.1 样品DNA和蛋白质的CE检测 参考文献[12,13]方法,分别对样品DNA和蛋白质进行分离分析。样品DNA为提取的胃癌组织p53基因PCR扩增产物经纯化后的产物，样品蛋白质为提取的胃癌组织蛋白质混合物，结果见图7。图7a为样品DNA的CE图，其出峰时间约11 min；图7b为样品蛋白质的CE图，由于提取的蛋白质为混合物，有多个样品峰出现，在15 min内完成分离。�
　　[TS（] 图7 毛细管电泳检测胃癌组织p53基因PCR产物和蛋白质混合物以及二者相互作用产物�
　　Fig．7 Result of the p53 gene fragment, protein complex, and p53�protein interaction products detection of gastric cancer tissue （a）. p53 gene fragment, （b）. protein complex, （c）. p53�protein interaction products[TS）]
　　3.3.2 样品DNA�蛋白质相互作用产物的CE检测 将优化得到的CE检测DNA�蛋白质标准物相互作用产物的最佳分离条件用于3.3.1样品的分析，结果见图7c。目的基因p53基因包含282位密码子突变位点的一段约200 bp的DNA序列，p53基因突变伴随突变型p53蛋白的聚积，由于突变型p53蛋白稳定性增加，因而易于检测��[14]�。结合DNA和蛋白质Marker的迁移CE图，将样品DNA和蛋白质单独进样时的CE图与二者相互作用产物的CE图对比后发现，与目的基因片段结合的蛋白质分子量大约在44～66 kDa，推测可能是p53基因的表达蛋白。另外，蛋白质与DNA相互作用后，还可能出现结合后核质比相近而难以分开的情况，此时需要结合出峰时间进一步判断，必要时用传统的聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）方法进行检测，将与特定基因片段结合的蛋白质从PAGE胶上回收，结合质谱等手段得到蛋白质的信息，并在此基础上进一步论证二者相互作用的方式及其机理。�
　　3.4 小结�
　　考察了NGS�CE分离pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA Marker和Protein Molecular Weight Marker （Broad） D532S相互作用产物的最佳实验条件，并用于分析胃癌组织DNA�蛋白质相互作用产物的检测， 效果较好。�
　　�
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　　�
　　Detection Method of Deoxyribonucleic Acid�Protein �
　　Interaction Products and Its Application in Gastric Cancer Tissue
　　��
　　ZHANG Ai�Mei��1,2�, SUN Kun��*1�, WANG Rong��*3�, XIE Hua�3,�� �XIE Xi�Hui �3, SHI You�Qin�3
　　�
　　���1�（College of Chemistry and Chemical Engineering, Northwest Normal University, Lanzhou 730070）�
　　��2� （College of Life Science, Northwest Normal University, Lanzhou 730070）�
　　�3�� �（Department of Pharmacy, Lanzhou General Hospital of the Chinese People′s Liberty Army, Lanzhou 730050）
　　��
　　�
　　Abstract A method was established to separate DNA�protein interaction products by non�gel sieving capillary electrophoresis with laser induced fluorescence （NGS�CE�LIF）. A series of effects on CE were studied, namely sieving medium concentration, separation temperature, separation voltage, pH value of Tris�Borate�EDTA （TBE） buffer. The results indicated that pUC19 DNA/MspⅠ（HpaⅡ） DNA marker and protein molecular weight marker （Broad） D532S interaction products were effectively separated when sieving medium was 0.1% （�w/V�） poly （ethylene oxide） （ 300000）, electrophoresis buffer was �1×TBE （pH9.0）�, separation voltage was 15 kV, and temperature was 15 ℃. The �detection� method of DNA�protein interaction products was used to analyze the interaction of the �products� of PCR of p53 gene and protein complex from gastric cancer tissue. The method has high detection rate and good separation efficiency.�
　　Keywords Deoxyribonucleic acid; Protein interaction; Non�gel sieving capillary electrophoresis; �Laser�induced fluorescence detection; Poly（ethylene oxide）; Gastric cancer tissue��
　　
　　（Received 9 March 2011; accepted 23 June 2011）�

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