水大肠杆菌检测方法 浑河水的大肠杆菌检测方法的研究
时间：2020-03-06 07:30:22 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
中图分类号：TS207 文献标识码:A 文章编号：1007-0745（2011）11-0073-01 摘要：发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产算产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂。
平板培养基一般使用伊红美蓝培养基，伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。
关键词：大肠杆菌 浑河 革兰氏染色平板分离
（一）、立论依据
1、 水的微生物检验是衡量水质量的重要指标之一，也是判定被检水能否食用的科学依据之一。
2、通过水的微生物检验，可以判断水加工环境及食品卫生环境，能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据，提供传染病和人类、动物和食物中毒的防治措施。
（二）、研究方案
1、研究目标：
浑河，是纵贯辽宁省东部和中部的著名河流，长368公里，又称小辽河。以我国饮用水卫生标准为依据，检测各不同采样段的浑河水中的细菌及大肠菌群数，以此判断浑河水的水质。
2、解决的关键问题
（1）水样的采集
（2）水中细菌总数和总大肠菌群的测定
3、研究方法
（1）细菌总数测定采用平板菌落计数法
（2）初发酵试验
发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德小套管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖产算产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为PH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色。溴甲酚紫还可以抑制其他细菌，如对芽孢菌的生长抑制。
（3）平板分离
平板培养基一般使用伊红美蓝培养基，伊红美蓝琼脂平板含有伊红和美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群产生带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。初发酵管24h内产酸产 气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离，培养后，将符合大肠菌群菌落特征的菌落进行革兰氏染色，只有染色为革兰氏阴性、无芽孢杆菌的菌落，才是大肠菌群菌落。
（4）显微镜直接计数法是将少量待测样品的悬浮液置于血细胞计数板上，放在显微镜下直接观察。1ml细菌数=每小格细菌数*16*25。若细菌在边缘，看右不看左，看下不看上。
4、实验方案：大肠杆菌的检验
（1）培养基的制备
1牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏（3g）、蛋白胨（10g）、氯化钠（5g）、琼脂（15-20g）、水（1000ml）、PH（7.0-7.2） 2伊红美蓝培养基(100ml) 20%乳糖溶液（2ml）、2%伊红水溶液（2ml）、0.5%美蓝水溶液（1ml） 3乳糖蛋白胨培养基、 蛋白胨（10g）、牛肉膏（3g）乳糖（5g）、氯化钠 （5g）、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1ml）、蒸馏水（1000ml）ph（7.2-7.4）
用水浴锅煮沸搅拌，之后导入锥形瓶中，趁热缓慢导入培养皿中。121摄氏度灭菌20分钟。
（2）培养基的检验
将培养基放到22 ℃和37 ℃分别培养2d，观察是否有菌落，若没有菌落形成继续下面实验。
（3）样品的获取：
自来水（对照试验）、浑河水样
1检测浑河水
2检测自来水
（4）样品处理：多管发酵法测定水中总大肠杆菌菌群
1自来水样的检测
a）在2个含有50mL 3倍浓缩的乳糖蛋白胨发酵瓶中，加各入100ml水样。在10支含有5ml的3倍浓度乳糖浓度蛋白胨发酵管中，各加入10ml水样均匀混合后在37摄氏度培养24小时，24小时未产生气体继续培养至48小时。
b）平板分离：将24小时培养后产酸的气体和48小时培养后产酸产气的发酵管分别画线接种于伊红美兰琼脂培养基平板上，在于37度下培养18-24小时，将符合以下特征的菌落：有金属光泽；紫黑色，不带或者略带金属光泽；淡紫红色，中心颜色较深，其中的一小部分进行涂片，革兰氏染色，镜检
c）复发酵实验：经涂片、染色、镜检，如果是革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取该菌落的另一部分，重新接种于普通浓度的乳糖蛋白胨发酵管中，每管可接种来自同一初发酵管的同类型菌落1-3个，37度培养24小时，实验结果若产酸又产气，即证实又大肠杆菌存在。
2浑河水的检测
水样采取后，检测水样的稀释浓度和接种水样的总量，取决于估计水清洁或污染的程度，一般是：清洁水不需稀释，接种水样300ml，其中2分100ml，10份10ml；水轻度污染，稀释成0.1，接种水样111.1ml其中100ml、10ml、1ml、0.1ml各一份；水中度污染，稀释成0.1 和0.01，，接种水量11.11ml其中10ml、1ml、0.1ml、0.01ml各一份；水严重污染，稀释成0.1、0.01、0.001，接种水样总量1.111ml，其中1ml、0.1ml、0.01ml、0.001ml各一份。
a)将水样稀释0.1、0.01
b)分别吸取1mL 0.01、0.1的稀释水样和1ml原水样，各级注入装有10ml普通浓度乳糖蛋白胨发酵管中。另取10ml和100ml原水样，分别注入装有5ml和50ml 三倍浓缩乳糖蛋白胨发酵液试管中。混匀后，37摄氏度培养24小时，若没有气体产生继续培养48小时。
（5）数量评估
每个水样取一毫升，用显微镜直接计数法估测里面的细菌数量。根据不同情况选择不同的溶液稀释倍数
（6）浓度梯度溶液的制作
根据选择水样的不同，每种水样稀释三种不同的浓度，每种浓度做三次试验，制作浓度梯度溶液。
（7）数量检测：
用灭菌吸管取1ml稀释X倍的水样注入灭菌的培养皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃的牛肉膏蛋白胨培养基，并立即放在平整的桌面上，作平面旋转，使水样与培养基充分混合。
（8）数量观察：
培养基凝固后倒置于37 ℃培养24h之后进行菌落统计。统计时候一定注意稀释的倍数。
参考文献:
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