基于p38MAPK、AMPK,探讨华蟾毒精杀伤人肝癌细胞的机制
时间：2023-06-25 10:25:04 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
曹 秀，向远彩，邓程凤，代荣阳，刘友平
（西南医科大学生物化学与分子生物学教研室，四川 泸州 646000）
原发性肝癌主要为肝细胞癌（占75%～85%），是全球第6 大最常见的恶性肿瘤，致死率居第4 顺位，每年新发病例超过84 万，其中50%发生在中国［1］。肝癌目前主要的治疗手段有切除移植、放化疗和外科手术综合治疗。多数患者因发病隐匿，通常在晚期确诊且合并肝硬化，治疗选择受到限制，预后较差［2-3］。近年来，中药以其来源广泛、价格低廉、毒副作用较低等优点，被普遍用于实验研究和临床。华蟾毒精是中药蟾酥的主要活性成分之一，具有抑制肿瘤增殖和血管形成，诱导肿瘤细胞凋亡的作用［4］。大量研究发现，华蟾毒精对肝癌［5-6］、前列腺癌［7］、结直肠癌［8］等都具有杀伤作用，但其具体的抗肿瘤机制还缺乏深入的认识。已有研究表明，华蟾毒精可通过激活p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号通路诱导胃癌［9］、骨肉瘤细胞凋亡［10］，而p38MAPK 又可作为腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路的下游分子诱导骨肉瘤细胞凋亡［11］。因此，本实验采用华蟾毒精处理肝癌细胞系SKHep1 和HepG2，通过检测凋亡标志蛋白聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］、DNA损伤标志蛋白磷酸化的组蛋白H2AX（γ-H2AX）、pp38MAPK 及p-AMPK 等表达，以研究华蟾毒精对肝癌细胞的杀伤作用机制，为华蟾毒精治疗肝癌提供新的实验依据。
1.1 药物与试剂 华蟾毒精（纯度98.90%，CAS 号470-37-1）购自美国MedChemExpress 公司。Lipofectamine3000转染试剂购自美国Invitrogen 公司；
1×OptiMEM 无血清培养液购自美国Gibco 公司；
乳酸脱氢酶细胞（LDH）毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；
PARP、γ-H2AX、H2AX、p-p38、p38、p-AMPK、AMPK 一抗均购自美国Cell Signaling Technology 公司；
甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）一抗购自美国Santa Cruz 公司；
阴性对照（NC）-siRNA、AMPKα1-siRNA、p38MAPK-siRNA 购自上海吉玛制药技术有限公司，引物序列见表1。
表1 引物序列
1.2 仪器 二氧化碳恒温培养箱（美国Thermo 公司）；
倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）；
低温离心机（美国Thermo 公司）；
酶标仪（美国Bio-Tek 公司）；
红外发光成像系统（美国LI-COR 公司）；
电泳系统（美国Bio-Rad 公司）。
2.1 细胞培养 人肝癌细胞SK-Hep1 和HepG2 购自中国科学院上海细胞库，用含10% FBS 的DMEM 培养基，于5% CO2、37 ℃加湿孵箱中培养，细胞单层贴壁生长，视具体状态更换培养基。
2.2 乳酸脱氢酶（LDH）法检测细胞毒性 取对数期肝癌细胞接种到96 孔板中，细胞培养箱中培养24 h，每孔加入不同浓度华蟾毒精（5、10、25、50 nmol／L），以DMSO 为空白对照，不做任何处理为最大酶活性对照孔，每个浓度设置3 个复孔，继续培养12 h，检测前1 h，在最大酶活性对照孔中加入LDH 释放液后继续放入培养箱中培养，1 h后将96 孔板在400×g条件下离心5 min，各孔取80 μL 上清液加入到新的96 孔板中，再向每孔中加入30 μL LDH 工作液，混匀后室温避光孵育30 min，用酶标仪在490 nm 波长处检测吸光度值。
2.3 siRNA 转染 将细胞接种在6 孔板中，待融合度达70%～80% 时，PBS 洗2 次，每孔加入800 μL Opti-MEM。将2.5 μLNC／ AMPKα1／p38MAPK-siRNA 与100 μL 无血清培养液的1×Opti-MEM 混合，同时将4 μL Lipofectamine 3000 转染试剂与100 μL Opti-MEM 混合，静置5 min，将2种溶液混合静置15 min 后，加入到对应的孔内，放入培养箱中培养6～8 h，更换正常培养基培养18 h 后，用DMSO或50 nmol／L 华蟾毒精处理12 h，收集细胞用于Western blot 检测。
2.4 Western blot 法检测细胞PARP、γ-H2AX、p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表达 取对照组（DMSO）、华蟾毒精组（5、10、25、50 nmol／L）及干扰AMPK／p38MAPK ＋华蟾毒精（50 nmol／L）组的肝癌细胞，用IP 裂解液于冰上提取细胞总蛋白，超声破碎，4 ℃离心后，采用BCA 法进行蛋白定量，具体操作按照试剂盒说明书进行，将蛋白样品与上样缓冲液充分混匀，通过SDS-PAGE 凝胶电泳、湿转、封闭、切膜，加入一抗于4 ℃冰箱孵育过夜，TBST 洗涤3 次，加入二抗室温避光孵育1 h，TBST 洗涤3 次，Odessey-CLX 扫描显影，即得到目的蛋白的免疫印迹图。
2.5 统计学分析 通过GraphPad Prism 8.3.0 软件进行处理，计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。
3.1 华蟾毒精对肝癌细胞的影响
3.1.1 华蟾毒精对肝癌细胞毒性的影响 与0 nmol／L 华蟾毒精组比较，5、10、25、50 nmol／L 华蟾毒精处理12 h后，SK-Hep1 和HepG2 细胞LDH 释放量均增加，细胞毒性增强，并呈浓度依赖性，见图1A～1B。随后选用效果最为显著的50 nmol／L 华蟾毒精处理肝癌细胞6、12 h，与对照组（DMSO）比较，50 nmol／L 华蟾毒精组SKHep1 和HepG2 细胞LDH 释放量均增加（P＜0.05），细胞毒性增强，并呈时间依赖性，见图1C～1D。结果表明，华蟾毒精对肝癌SK-Hep1 和HepG2 细胞具有明显的毒性作用。
图1 华蟾毒精对肝癌细胞毒性的影响（±s， n＝3）
3.1.2 华蟾毒精对肝癌细胞凋亡和DNA 损伤的影响 与对照组（DMSO）比较，5、10、25、50 nmol／L 华蟾毒精处理肝癌细胞12 h 后，凋亡相关蛋白PARP 以及DNA 损伤标志蛋白γ-H2AX 均呈剂量依赖性升高（P＜0.05），见图2A～2D；
50 nmol／L 华蟾毒精处理肝癌细胞6、12 h 后，PARP及γ-H2AX 蛋白表达均呈时间依赖性升高（P＜0.05），见图2E～2H。结果表明，华蟾毒精可以诱导肝癌细胞凋亡和DNA 损伤。
图2 华蟾毒精对人肝癌细胞凋亡和DNA 损伤的影响（±s， n＝3）
3.1.3 华蟾毒精对肝癌细胞p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表达的影响与对照组（DMSO）比较，5、10、25、50 nmol／L 华蟾毒精处理肝癌细胞12 h 后，细胞p-38MAPK、p-AMPK 蛋白表达升高（P＜0.05），见图3A～3D；
此外，50 nmol／L 华蟾毒精处理肝癌细胞6、12 h 后，p-38MAPK、p-AMPK 蛋白表达均呈时间依赖性升高（P＜0.05），见图3E～3H。结果表明，华蟾毒精可激活肝癌细胞p38MAPK 和AMPK 表达。
图3 华蟾毒精对肝癌细胞p-p38MAPK、p-AMPK 蛋白表达的影响（±s， n＝3）
3.2 干扰p38MAPK 表达后华蟾毒精对肝癌细胞的影响
3.2.1 华蟾毒精通过p38MAPK 诱导肝癌细胞凋亡和DNA损伤 与siNC＋华蟾毒精组比较，sip38＋华蟾毒精组细胞PARP 和γ-H2AX 蛋白表达均降低（P＜0.05），见图4。结果表明，华蟾毒精通过激活p38MAPK 诱导肝癌细胞凋亡和DNA 损伤。
图4 华蟾毒精通过p38MAPK 诱导肝癌细胞凋亡和DNA 损伤（±s， n＝3）
3.2.2 干扰p38MAPK 表达后对肝癌细胞中p-AMPK 表达的影响 抑制p38MAPK 基因表达后，p-AMPK 蛋白表达升高（P＜0.05）；
与siNC＋华蟾毒精组比较，sip38＋华蟾毒精组p-AMPK 蛋白表达进一步升高（P＜0.05），见图5。结果表明，下调p38MAPK 基因的表达可激活肝癌细胞中AMPK表达。
图5 干扰p38MAPK 后对肝癌细胞中p-AMPK 和p38 蛋白表达的影响（±s， n＝3）
3.3 干扰AMPK 表达后对华蟾毒精诱导肝癌细胞凋亡和DNA 损伤的影响 与siNC＋华蟾毒精组比较，siAMPKα1＋华蟾毒精组肝癌细胞p-AMPK 蛋白表达降低（P＜0.05），PARP、γ-H2AX、p-p38MAPK 蛋白表达升高（P＜0.05），见图6A～6D；
乳酸脱氢酶检测结果显示siAMPKα1＋华蟾毒精组LDH 水平升高（P＜0.05），见图6E～6F。结果表明，敲低AMPK 能够促进华蟾毒精诱导的肝癌细胞凋亡和DNA损伤。
图6 干扰AMPK 表达后对华蟾毒精诱导肝癌细胞凋亡和DNA 损伤的影响（±s， n＝3）
原发性肝癌是全球癌症相关发病率和死亡率高的主要原因之一，临床上常用的治疗方法均不能有效控制肿瘤的扩散和转移。广谱化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会损伤机体的免疫系统，但与中医药结合可提高其治疗效果［12-13］。最新肝癌治疗指南也推荐了若干种现代中药制剂用于手术切除后的辅助治疗，可显著缓解化疗药物的副作用，改善晚期肝癌的生存率［14］。华蟾毒精是从中华大蟾酥中提取分离出的主要活性成分，对包括肝癌、结直肠癌、多发性骨髓瘤［15］等肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。本研究探索了华蟾毒精对人肝癌细胞系SK-Hep1 和HepG2 的影响及其分子机制。
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，主要包括线粒体途径、死亡受体途径及其上游信号转导，例如MAPK 途径、PI3K／Akt 途径、NF-κB 途径等［16］。多项研究指出，无论是放化疗药物、细胞毒性药物还是靶向药，激活肿瘤促凋亡通路是治疗肝癌细胞的一条有效途径［17-18］。本实验发现，华蟾毒精可诱导肝癌细胞发生凋亡。p38MAPK 属于MAPKs 家族，参与细胞增殖、分化、凋亡等众多生物学进程，活化的p38MAPK 可以通过降低Bcl-2／Bax 比值，诱导线粒体功能障碍，进而引起细胞凋亡［19］。本研究结果显示，华蟾毒精上调了肝癌细胞中p-p38MAPK 蛋白表达，提示华蟾毒精杀伤肝癌细胞可能与p38MAPK 通路的激活有关。近年来，p38MAPK 作为一种肿瘤抑制因子引起广泛的关注，如在HeLa 细胞中p38MAPK 的激活可特异性抑制肿瘤的形成［20］；
在化疗过程中顺铂可以激活p38MAPK 通路，达到杀伤肿瘤的作用，因此可作为顺铂的特异性治疗靶点，具有重要临床意义［21］。本实验也发现，华蟾毒精可激活p38MAPK，而敲低p38MAPK 表达后，华蟾毒精诱导的肝癌细胞凋亡和DNA 损伤效率降低，且p-AMPK 表达呈现上升趋势，说明在肝癌细胞中华蟾毒精可通过激活p38MAPK 发挥杀伤肿瘤的作用，且提示AMPK 也参与其中。
AMPK 作为真核细胞的能量感受器，能够协调包括自噬、凋亡、细胞周期和蛋白质合成在内的一系列细胞过程，与人类疾病的发生发展密切相关，已成为许多代谢综合征和肿瘤治疗的重要靶点［22］。近年来的诸多研究发现，AMPK 在肿瘤的发生发展过程中发挥双重功能［23］，如AMPK 可作为一个肿瘤抑癌因子，负性调节癌细胞Warburg效应从而抑制肿瘤的生长［24］；
又可作为肿瘤的保护因子，通过直接磷酸化CREB1 促进下游HIF1α 的转录激活，从而促进葡萄糖代谢，达到加速胶质母细胞瘤生长的作用［25］；
也可通过调控不同的信号通路促进结肠癌［26］、乳腺癌［27］的生长。本实验结果显示，华蟾毒精可上调肝癌细胞中p-AMPK蛋白表达，进一步研究发现敲低AMPKα1 后华蟾毒精诱导的肝癌细胞凋亡和DNA 损伤程度增加，pp38MAPK 蛋白表达也升高，表明AMPK 可以保护肿瘤抵抗华蟾毒精的杀伤作用。值得注意的是本研究发现p38MAPK 与AMPK 之间似乎存在相互调控的关系，有待进一步的实验验证。
综上所述，在华蟾毒精杀伤人肝癌细胞SK-Hep1 和HepG2 的过程中，p38MAPK 的激活可促进肝癌细胞的凋亡和DNA 损伤，而AMPK 的激活可抑制肝癌细胞的凋亡和DNA 损伤，推测在人肝癌细胞中华蟾毒精激活p38MAPK的力度大于AMPK，最终达到杀伤肿瘤的作用。本研究不仅为华蟾毒精治疗肝癌的临床应用提供新的理论基础，也有望为华蟾毒精治疗肝癌提供新的思路。
猜你喜欢肝癌诱导蛋白齐次核诱导的p进制积分算子及其应用数学物理学报(2021年4期)2021-08-30同角三角函数关系及诱导公式新世纪智能(数学备考)(2020年10期)2021-01-04LCMT1在肝癌中的表达和预后的意义天津医科大学学报(2019年3期)2019-08-13续断水提液诱导HeLa细胞的凋亡中成药(2017年12期)2018-01-19猪胎盘蛋白的分离鉴定中成药(2017年8期)2017-11-22大型诱导标在隧道夜间照明中的应用中国交通信息化(2017年8期)2017-06-06自噬蛋白Beclin-1在胆囊癌中的表达及临床意义中国现代医学杂志(2015年26期)2015-12-23microRNA在肝癌发生发展及诊治中的作用肿瘤预防与治疗(2015年1期)2015-09-26SAK －HV 蛋白通过上调 ABCG5／ABCG8的表达降低胆固醇的吸收医学研究杂志(2015年7期)2015-06-22Rab27A和Rab27B在4种不同人肝癌细胞株中的表达中国当代医药(2015年16期)2015-03-01
