吡嗪类碳酰肼化合物与CT-DNA相互作用及体外抑菌活性

张余珍, 刘向荣,2*, 杨再文,2, 赵顺省,2

(1. 西安科技大学 化学与化工学院,陕西 西安 710054;2.自然资源部煤炭资源勘查与综合利用重点实验室,陕西 西安 710021)

新药物的研发关系到人类健康和社会发展的可持续性。大多数药物,尤其是抗菌药物,长期使用会导致细菌产生耐药性,从而影响药物疗效。对于应用时间越长,使用范围越广的抗菌药物,细菌的耐药性往往越严重[1]。四环素是抑制细菌蛋白合成的一种广谱抑菌剂,早在1948年开始用于临床,对常见的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有良好的抑菌作用。然而,近年来由于病菌对此类抑菌药物耐药性普遍升高以及此类药物引起的不良反应增多,药物的临床应用受到很大的限制[2]。因此,新型抑菌药物的研发一直是研究者们关注的焦点。

酰肼(—CO—NH—NH—)类化合物以及含腙(—C=NHN—)基团化合物因其具有抗菌[3-4]、抗癌[5-6]、抗病毒[7]和杀虫[8]等生物活性,被广泛用于医药和农药领域[9]。吡嗪是一类双氮杂环化合物,易降解和毒性小的特点奠定了其在新型药物分子研发过程中的重要性[10]。据统计,美国FAD批准上市的小分子药物中75%以上都含有氮杂环结构[11]。因此,向酰肼化合物中引入活性结构腙基团和吡嗪环制备新型抑菌药物具有重要意义。小牛胸腺DNA(CT-DNA)是一种天然DNA,是药物分子发挥作用的重要靶点。通过化学分析测试的方法研究药物分子和CT-DNA相互作用的强弱,能够判断药物分子的生物活性。YANG等[12]利用紫外-可见光谱和荧光光谱法对合成的3种吡嗪类酰腙化合物1～3与CT-DNA的相互作用进行了研究,结果证明其与CT-DNA相互作用的强弱顺序为2>1>3,并以金黄色葡萄球菌作为实验菌种,测得化合物1～3的抑菌活性大小顺序为2>1>3,与光谱法测试的结果一致。张军军等[13]通过紫外-可见光谱法和黏度法发现合成的4种新型吡啶类化合物1～4与CT-DNA相互作用强弱顺序为3>2>1>4,并对耻垢分枝杆菌进行了抑菌活性研究,结果表明抑菌活性大小顺序也是3>2>1>4。CEREN等[14]采用紫外-可见光谱法和电化学法对合成的6种新型3-亚氨基衍生物与CT-DNA相互作用进行了研究,发现化合物3与CT-DNA相互作用最强,并测得化合物3对癌细胞株MCF-7、 SKOV-3、 HuP-T3和PC3均达到最优抑制活性。由此可见,药物分子与CT-DNA相互作用越强,生物活性越好。相较于直接利用生物方法测试药物分子的生物活性,以化学分析测试方法研究药物分子与CT-DNA相互作用强弱来判断药物分子的生物活性具有更加快速、便捷和能大批量测试的优点[15],也受到越来越多研究者的采用。目前,主要利用光谱法、微量热法、分子对接法、电化学法和黏度法等化学分析测试的方法研究药物分子与CT-DNA的相互作用[16-18]。其中,微量热法能够直接测出药物分子与CT-DNA相互作用的具体作用时长以及焓变(ΔH)等热力学参数[18]。另外,分子对接模拟计算技术也越来越多地被用来模拟药物分子与DNA的最佳结合方式与具体结合位点,从而推测结合机制[20]。

本研究利用生物活性相叠加的原理[21],向酰肼化合物中引入活性结构腙基团和吡嗪环,设计合成了3种新型吡嗪类碳酰肼化合物a～c。采用元素分析和核磁共振氢谱对化合物a～c进行了表征。通过溶剂挥发法培养得到了化合物a的单晶,并利用X-射线单晶衍射测定化合物a的晶体结构。采用紫外-可见光谱研究化合物a～c与CT-DNA相互作用的模式;通过微量热实验测定了化合物a～c与CT-DNA相互作用的具体时长以及热力学参数;利用分子对接模拟计算了化合物a～c与DNA相互作用的具体结合位点。通过牛津杯实验,以四环素为阳性对照,DMSO为阴性对照,测定了化合物a～c分别对两种常见的革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌)和两种常见的革兰氏阴性菌(铜绿假单胞菌、大肠杆菌)的体外抑菌活性,发现抑菌活性优良的新型吡嗪类碳酰肼化合物。化合物a～c的合成路线见图1。

图1 a～c的合成路线

1.1 仪器与试剂

Bruker Apex-Ⅱ CCD型X-射线单晶衍射仪(美国Bruker Smart公司);WRS-IB型熔点仪(中国北京佳航博创科技有限公司);PE-2400-Ⅱ型元素分析仪、GXIV5.0.1型傅里叶变换红外光谱仪(美国Perkin Elmer公司);Bruker-400M型核磁共振波谱仪(德国Bruker公司);TU-1900型紫外-可见分光光度计(中国北京普析通用仪器公司);C80微量热仪,(法国Setaram公司)。

5-氯-吡嗪-2-羧酸甲酯、水合肼(80%)、对甲基苯甲醛、对甲氧基苯甲醛、对羟基苯甲醛等购自Aladdin试剂(上海)有限公司;CT-DNA(小牛胸腺DNA)为生物试剂,购自美国Sigma公司;枯草芽孢杆菌(CICC No.24675)、金黄色葡萄球菌(CICC No.10001)、铜绿假单胞菌(CICC No.10204)和大肠杆菌(CICC No.10003)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC);琼脂粉、蛋白胨、酵母浸粉等购自北京奥博星生物技术有限公司。以上试剂使用前均未处理。

1.2 化合物a～c的合成

(1) 5-肼基-吡嗪-2-碳酰肼的合成

向150 mL圆底烧瓶中加入8.629 g(50 mmol)的5-氯吡嗪-2-羧酸甲酯和50 mL无水乙醇,溶解,加入10 mL 80%水合肼,75 ℃下回流反应4～5 h。抽滤,得到的滤饼即为粗产物,用乙醇对其洗涤3次,过滤烘干,得橘黄色固体5-肼基-吡嗪-2-碳酰肼,产率89.7%; m.p. 240.81～241.21 ℃;1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ: 9.39(s, 1H), 8.61(s, 1H), 8.48(s, 1H), 8.05(s, 1H), 4.45(s, 4H); IR(KBr)v: 3331, 3290, 3207, 3140(N—H), 1641(C=O), 1295(C—N) cm-1; Anal. calcd for C5H8N6O: C 35.71, H 4.80, N 49.98, found C 35.92, H 4.37, N 49.50。

(2) 化合物a～c的合成

向150 mL圆底烧瓶中加入0.841 g(5 mmol)的5-肼基-吡嗪-2-碳酰肼和50 mL无水乙醇,加热搅拌使其完全溶解,加入585 μL的4-甲基苯甲醛(5 mmol),75 ℃下回流反应4～5 h,使其完全反应,过滤后将滤液静置3 d后出现淡黄色针状晶体,即为化合物a的单晶,用于X-射线单晶衍射测试,产率67.8%; m.p. 245.24～245.74 ℃; IR(KBr)v: 3375, 3203, 3111(N—H), 3006(C—H), 1665(C=O), 1590(C=N), 1400(C—N) cm-1。

化合物b的合成方法与化合物a相似,反应试剂及条件均不变,只需将4-甲基苯甲醛替换成4-甲氧基苯甲醛即可,得到黄色粉末状的化合物b,产率69.7%; m.p. 233.76～234.96 ℃; IR(KBr)v: 3418, 3303, 3193(N—H), 3006(C—H), 1659(C=O), 1573(C=N), 1400(C—N), 1252(C—O—C) cm-1。

化合物c的合成方法与化合物a相似,反应试剂及条件均不变,只需将4-甲基苯甲醛替换成4-羟基苯甲醛即可,得到黄色粉末状的化合物c,产率59.7%; m.p. 218.43～219.07 ℃; IR(KBr)v: 3729(O—H), 3384, 3342, 3198(N—H), 3006(C—H), 1651(C=O), 1596(C=N), 1400(C—N), 1230(C—O) cm-1。

1.3 化合物a的晶体结构测试

化合物a的单晶衍射数据在Bruker Apex-Ⅱ CCD X-射线单晶衍射仪上完成。在173.00 K下,以石墨单色器单色化的Mo靶X-射线作为入射光源,利用SHELXL程序[22]解析及精修化合物a的单晶结构,并用全矩阵最小二乘法对晶体结构进行修正。

1.4 化合物a～c与CT-DNA相互作用研究

缓冲液:1.0×10-2mol·L-1, pH=7.9的Tris-H2O-HCl; CT-DNA溶液和化合物a～c溶液:1.0×10-4mol·L-1,用缓冲液配制。

(1) 化合物a～c的紫外-可见光谱

分别将3 mL缓冲液和3 mL化合物溶液加入参比池和样品池,在样品池中逐次滴加50 μL CT-DNA溶液,连续滴加5次,每次滴加后等待5 min,扫描范围为200～600 nm。

(2) 化合物a～c的微量热实验

分别将1 mL缓冲液和1 mL化合物溶液加入参比池和样品池的下层,中间用隔膜分开,在参比池和样品池的上层分别加入1 mL的CT-DNA溶液。升温速率为0.001 ℃/min, 25 ℃下,待基线平稳后混合两层溶液,测定化合物的热流曲线。

(3) 化合物a～c的分子对接模拟

本文所有对接在AutoDock 4.2上进行,对接过程采用半柔性对接[23]。DNA序列为1XWR(PDB-ID),从RCSB蛋白数据库中下载。对接网格以DNA为中心,格点间隔0.375 Å,网格大小100 Å×70 Å×70 Å,保证对接区域覆盖整个DNA片段。对接过程中,使用Lamarckian遗传算法[24],计算轮数100。软件PyMOL和Discovery Studio 4.5用于可视化处理[25]。

1.5 化合物a～c的体外抑菌测定

在培养皿中加入20 mL LB培养基(组成:10 g NaCl、10 g蛋白胨、5 g酵母粉和1000 mL蒸馏水),在培养基表面均匀涂抹一定量的菌液(菌液浓度为106cfu·mL-1),将牛津杯呈正三角形放置于涂抹菌液的LB培养基表面,向牛津杯中加入化合物溶液后用封口膜封口,于37 ℃恒温培养箱中培养17～18 h,测量三个抑菌圈直径并取平均值。

2.1 化合物a～c的组成及结构表征

(1) 元素分析

通过元素分析测定了化合物a～c的C、H和N组成,结果见表1。由表1可看出实际测量值与理论计算值的C、 H和N百分比含量相近,说明合成的化合物a～c较为纯净,且合成的化合物a～c在元素组成上符合目标化合物。

表1 a～c的元素分析

(2) 核磁共振氢谱分析

化合物a～c的核磁共振氢谱见图2,化合物a～c中—CONH—的质子峰出现在δ11.57～11.43之间;δ9.87处为化合物c中—OH上的质子峰;化合物a～c中—C=NNH—的质子峰出现在δ9.61～9.58之间;吡嗪环上的质子峰出现在δ8.66～8.61和8.12～8.09之间;—N=CH—上的质子峰出现在δ8.55～8.49之间;苯环上的质子峰出现在δ7.68～6.84之间;—NH2上的质子峰出现在δ4.55～4.53之间;δ3.81处为化合物b中—OCH3上的质子峰;δ2.35处为化合物a中—CH3的质子峰。化合物a～c中氢原子个数与理论个数相同,说明合成的化合物即为目标产物。

δ

(3) 化合物a的晶体结构分析

化合物a的单胞图见图3,单胞堆积图见图4,晶体学参数及主要键长及键角数据见表2。由表2晶体学参数可知,化合物a的晶体属于单斜晶系,空间群为C2/c,晶胞参数为a=17.321(2)Å,b=20.543(3) Å,c=11.4454(15) Å,α=90°,β=129.747(3)°,γ=90°, Z=8。

图3 化合物a的晶体结构

图4 化合物a的晶胞堆积

表2 a的晶体学参数和主要键长(nm)及键角(°)

化合物a中N5—C13键长为0.1332(3) nm, N5—N6键长为0.1411(2) nm,O1—C13的键长为0.1244(2) nm,是典型的C=O,说明化合物a中存在酰肼基团(—CONHNH—)。N1—N2的键长为0.1372(2) nm, C8—N1键长为0.1272(3) nm,为典型的C=N,说明化合物a中存在腙基团(—CNNH—)。苯环中的扭转角C2—C3—C4—C5、C3—C4—C5—C6、C4—C5—C6—C7分别为0.1(4)°、-0.6(4)°和0.2(4)°,吡嗪环中的扭转角C11—N3—C9—C10、C12—N4—C10—N9、N3—C9—C10—N4分别为0.1(3)°、 0.7(3)°和-0.5(3)°,表明苯环和吡嗪环之间存在一定的夹角。扭转角N1—N2—C9—N3、N2—N1—C8—C5、N6—N5—C13—O1、N6—N5—C13—C12分别为-179.6(2)°、 178.7(2)°、 -7.0(3)°和171.8(2)°,表明化合物a不具备良好的共平面性。化合物b和化合物c与化合物a除苯环对位基团不同外,其余结构均相同,因此,推测化合物b和化合物c同样不具备良好的共平面性。

2.2 化合物a～c与CT-DNA相互作用分析

(1) 紫外-可见光谱结果分析

化合物a～c在不同浓度CT-DNA下的紫外-可见光谱见图5～7。由图5～7观察到化合物a～c分别在358、 361和359 nm处出现最大吸收峰,随CT-DNA浓度的增大,化合物a～c呈现不同程度规律的减色效应,出现这种效应说明化合物以插入或沟槽的模式与CT-DNA相互作用。这是由于化合物本身存在的空π轨道与CT-DNA发生了耦合而填充部分电子,导致π-π*电子跃迁能量降低,出现了减色效应。此外,最大吸收波长伴有微弱的红移现象,而红移现象经常出现在插入作用中,主要表现为化合物与CT-DNA间的共轭作用增强,π-π*电子跃迁能量降低。

λ/nm

化合物a～c与CT-DNA相互作用的结合参数见表3。化合物与CT-DNA的结合常数Kb通过Benesi-Hildebrand方程算得。以[CT-DNA]/(εa-εf)对[CT-DNA]作图,见图8,所得直线斜率与截距之比即为Benesi-Hildebrand方程中Kb值。算得化合物a～c与CT-DNA相互作用的结合常数Kb值分别为1.54×106、 1.45×106和1.61×106L·moL-1,Kb越大,化合物与CT-DNA相互作用的结合能力越强[26]。因此,化合物a～c与CT-DNA相互作用的结合能力大小顺序为:c>a>b。

λ/nm

λ/nm

[CT-DNA]×10-5/(mol·L-1)

表3 化合物a～c与CT-DNA相互作用的结合参数

(2) 微量热实验结果分析

化合物a～c与CT-DNA相互作用的热流曲线图见图9。从图9可以看出化合物a～c与CT-DNA混合后发生了放热反应。化合物a～c的热流值分别在3.55、 3.91和3.77 min时刻达到最大,表明此刻化合物与CT-DNA作用效果最强。化合物a～c与CT-DNA相互作用的反应时长分别为33.91、 35.50和36.77 min,均在40 min以内,表明化合物a～c与CT-DNA的相互作用十分迅速。化合物a～c与CT-DNA作用时的焓变(ΔH)分别为-5.77×103、 -5.50×103和-5.96×103kJ·moL-1,焓变值越大,化合物与CT-DNA的相互作用越强,说明它们与CT-DNA相互作用的大小顺序为:c>a>b。

Time/min

化合物a～c与CT-DNA相互作用的焓变(ΔH)可通过C80微量热仪测得，作用过程的吉布斯自由能(ΔG)和熵变(ΔS)值通过热力学方程计算，计算,计算结果见表4。由表4可知:ΔH<0, ΔS<0,说明作用力是由氢键和范德华力占主导,ΔG<0, ΔS<0,说明化合物与CT-DNA分子间作用是自发进行的放热反应。

表4 化合物a～c与CT-DNA相互作用的热力学参数

(3) 分子对接结果分析

紫外-可见光谱结果证明化合物a～c与CT-DNA的结合方式为插入作用,因此,选择有嵌插间隙的DNA片段(PDB ID: 1XWR)作为与化合物a～c对接的DNA模型。

化合物a～c与DNA的对接结果见图10～12。根据分子对接模拟计算出化合物a～c与DNA对接的具体结合位点,结果列于表5。由图10～12以及表5可以看出化合物a和化合物b与DNA的结合位点包括A链DC4、 DG5和B链DC4、 DG5以及DA6,化合物c与DNA的结合位点包括A链DC4、DG5和B链DC4、 DG5。化合物a～c与DNA对接过程的相互作用包括氢键作用、疏水作用和静电作用,其中氢键作用和疏水作用是对接化合物a～c与DNA结合的主要作用力。对接化合物a～c中的苯环、吡嗪环、羟基、甲基碳、甲氧基碳、腙基团以及酰肼基团是对接化合物a～c与DNA相互作用过程最有利的结合位点。

图10 (ⅰ)化合物a在DNA中的最优对接姿势;(ⅱ) 化合物a与DNA对接模式及结合位点

表5 化合物a～c与DNA对接的具体结合位点

2.3 化合物a～c的体外抑菌活性分析

四环素(阳性对照,2.00 mg/mL)、 DMSO溶液(阴性对照)以及化合物a～c(系列浓度为2.00、 1.00、 0.50和0.25 mg/mL)对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌的生长抑制圈见图13～16,对4种菌的抑菌圈平均直径见表6。

化合物对细菌的生长抑制形成的抑菌圈越大,说明其抑菌活性越强。根据图13～16和表6数据可知,DMSO对4种细菌几乎没有抑制作用,而四环素对4种细菌均具有较强的抑制作用。化合物a～c对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌表现出良好的抑制活性。与对照药物四环素(2.00 mg/mL)相比,化合物a～c对铜绿假单胞菌表现出更优的体外抑菌活性。其中,化合物a表在浓度为1.00 mg/mL时,对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达到25.46 mm,化合物b在浓度为1.00 mg/mL时,对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达到24.11 mm,化合物c在浓度为2.00 mg/mL时,对铜绿假单胞菌的抑菌圈直径达到25.60 mm。

表6 化合物a～c的体外抑菌数据

图11 (ⅰ) 化合物b在DNA中的最优对接姿势;(ⅱ) 化合物b与DNA对接模式及结合位点

图12 (ⅰ) 化合物c在DNA中的最优对接姿势;(ⅱ) 化合物c与DNA对接模式及结合位点

图13 四环素(ⅰ)和DMSO(ⅱ)对测试菌种的抑菌圈(A、 B、 C和D分别代表枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌)

图14 化合物a对测试菌种的抑菌圈(A、 B、 C和D分别代表枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌)

图15 化合物b对测试菌种的抑菌圈(A、 B、 C和D分别代表枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌)

图16 化合物c对测试菌种的抑菌圈(A、 B、 C和D分别代表枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠杆菌)

本文合成了3种新型吡嗪类碳酰肼化合物a～c,通过溶剂挥发法培养得到了化合物a的单晶并采用X-射线单晶衍射测得化合物a的晶体结构为单斜晶系。紫外-可见光谱分析表明,化合物a～c与CT-DNA间的作用模式均为插入作用。微量热实验证明化合物a～c与CT-DNA相互作用大小顺序为:c>a>b。分子对接计算结果显示,化合物a～c与DNA分子相互作用的具体结合位点包括A链DC4和DG5以及B链DC4和DG5。体外抑菌实验表明,化合物a～c对铜绿假单胞菌表现出良好的抑菌活性,并且化合物c的抑菌活性最强,与微量热结果一致。因此,化合物c有望成为新型抗铜绿假单胞菌药物。

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