电针对多囊卵巢综合征小鼠机械痛阈及TRPV1,和CGRP,表达的影响*

徐晨曦 胡瑞斌 高昕妍,4 乔海法,2,3△ 袁 伟,2,3△

（1 陕西中医药大学针灸推拿学院，咸阳712046；
2 陕西省针药结合重点实验室，咸阳712046；
3 咸阳市神经生物学（针灸）重点实验室，咸阳712046；
4 中国中医科学院针灸研究所，北京100700）

多囊卵巢综合征 (polycystic ovary syndrome, PCOS)是育龄期女性中常见的内分泌疾病，临床主要特征为月经不调、持续无排卵、高雄激素，易引发不孕、心血管疾病、肥胖等多种并发症，对病人的生活质量有极大影响[1]。PCOS 发病机制尚不确定，通常多认为与炎症、代谢异常、遗传等多种因素有关[2]。

穴位选择是针刺干预的核心部分，穴位被认为是一个动态的功能区域，当机体遭受损伤或疾病时，相应穴位以压敏、痛敏、热敏、感受野扩大等表现形式被激活，随着健康状况而动态改变[3]。瞬时受体电位香草酸亚型1 (transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)，是非选择性阳离子通道之一，通常被机械痛、热刺激、辣椒素等伤害性刺激所激活，在伤害性感受感觉的传递和调节中起重要作用[4]。降钙素基因相关肽 (calcitonin gene related peptide, CGRP)，是一种感觉神经肽，由37 个氨基酸组成，主要存在于外周和中枢感觉神经系统中，CGRP 能够激活其效应细胞受体、增强伤害感受器敏感性[5]。CGRP 在TRPV1 激活后释放，机体受损时TRPV1、CGRP 在脊髓、背根神经节 (dorsal root ganglion, DRG) 中高度表达[6,7]。穴位敏化是一个动态而复杂的过程，TRPV1、CGRP 在穴位致敏中起着至关重要的作用[8]。

我国早已在针灸临床中认识到“以痛为输”选穴理论，干预敏化腧穴具有更好的疗效。机械痛阈降低是体表敏化的重要表现形式之一[9]，脊髓、DRG 组织中的CGRP 等痛敏递质释放，是参与伤害性感受信息调控与传递的重要环节[10,11]。本研究借助课题组前期研究，PCOS 小鼠尾静脉注射伊文思蓝(evans blue, EB) 后，选择神经源性渗出点重叠最多处作为针刺部位[12]，与临床妇科常用任脉经穴关元比较针刺效应差异，对针刺治疗该疾病的选穴有积极作用，具有一定的临床意义。针刺穴位选择区别于传统单一定位，更有助于解释穴位的本态研究，但其作用机制尚不明确。基于此，本研究继续通过双酚A (bisphenol A, BPA) 灌胃复制PCOS 动物模型，探讨PCOS 小鼠模型体表敏化的可能机制，为临床PCOS 针刺选穴提供参考及科学依据。

1.动物与分组

32 只SPF 级7 周 龄 雌 性ICR 小 鼠，体 质 量(29±2) g，购自西安交通大学动物中心，生产许可证号：SCXK（陕）2018-001，饲养于陕西省针药结合重点实验室，饲养温度 (22±2)℃，相对湿度 (50±10)%，12 h 昼夜交替循环照明，自由饮水、摄食。小鼠随机分为对照组（Con 组）、模型组（PCOS 组）、电针关元组（EA-CV4 组）、电针敏化点组（EA-sensitization 组），每组8 只。实验过程严格按照2006 年科技部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》及陕西省针药结合重点实验室动物相关管理规定（伦理审批号：SVCMDL20210901003）。

2.主要仪器和试剂

小动物麻醉机（深圳瑞沃德生命科技有限公司），韩氏电针仪（南京济生医疗科技有限公司），华佗牌针灸针（规格10 mm×0.19 mm，苏州医疗用品厂有限公司），vonFrey 测痛仪（美国IITC Life Science），酶标仪（美国Biotek），超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司），冰冻切片机、台式高速冷冻离心机（美国Thermo Fisher），荧光显微镜（德国Leica），电泳仪、化学发光成像系统（美国Bio-Rad）。

BPA（西安灏洋生物有限公司），TRPV1 抗体（美国abcam），CGRP 抗体（美国cell signaling），β-actin 抗体（武汉博士德生物工程有限公司），正常驴血清、Alexa Fluor 488 驴抗小鼠荧光二抗、Alexa Fluor 647 驴抗兔荧光二抗（上海翊圣生物科技有限公司），BCA 蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），HRP 标记山羊抗鼠/兔二抗（笛医生物科技有限公司）。

3.造模方法

采用BPA 灌胃的方式制备PCOS 小鼠模型[12]，除对照组外，各组小鼠按0.1 ml/10 g 剂量灌胃玉米油配置的BPA 溶液，每日1 次，连续5 天，共干预4 周，对照组以同等条件进行玉米油灌胃。HE 染色中小鼠卵巢组织具有囊性扩张、闭锁卵泡为模型制备成功的标准[13]。

4.干预方法

电针关元组根据《实验针灸学》选取关元穴，电针敏化组根据前期研究[12]，选取小鼠腹部脐下约8 mm，前正中线旁开约3 mm 两侧敏化点。用韩氏电针仪给予电针刺激，强度2.0 mA，频率2 Hz。每次20 min，每日1 次，连续5 天，共治疗4 周。对照组、模型组以同等条件进行抓取固定。

5. 观察指标及检测方法

（1）电子vonFrey 测定小鼠体表关元穴及腹部敏化点机械痛阈值：电针结束后第3 天，用探针缓慢刺激小鼠腹部针刺敏化点选取部位及关元穴，当小鼠出现甩尾、肢体抖动等躲避行为时，显示屏数值即为痛阈值，间隔3 min 重复测量3 次，取平均值。

（2）HE 染色法观察小鼠卵巢病理形态：每组取4只小鼠卵巢组织，多聚甲醛固定后蔗糖梯度脱水，OCT 冷冻包埋，冰冻切片机切片（厚度16 μm），HE 染色、中性树胶封片，显微镜下观察小鼠的卵巢组织形态。

（3）Western blot 法检测小鼠脊髓及DRG 组织中TRPV1、CGRP 蛋白表达：每组取4 只小鼠胸椎 (T)13-腰椎 (L)2节段脊髓及DRG 组织，RIPA 裂解液中静置20 min，超声破碎3 次×6 s，4℃离心提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度，将样品定量至5 μg/ml。用5%浓缩胶、15%分离胶进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后将蛋白转至PVDF 膜后室温封闭2 h，TRPV1 抗 体(1:2000)、CGRP 抗 体 (1:1000)，4℃孵育过夜，HRP 二抗 (1:10 000) 室温孵育2 h，TBST 洗膜10 min×3 次，滴加ECL 发光液，化学发光成像仪上检测。Image Pro-Plus 6.0 分析各条带的灰度值，TRPV1、CGRP 灰度值与β-actin 的比值作为TRPV1、CGRP 相对表达量，每组数据以对照组作归一化处理。

（4）免疫荧光染色法检测小鼠脊髓及DRG 组织中TRPV1/CGRP 阳性共表达：每组取4 只小鼠T13-L2节段脊髓及DRG 组织，多聚甲醛固定后蔗糖梯度脱水，OCT 冷冻包埋，冰冻切片机切片(16 μm)。用含3‰ TritonX 100 的驴血清封闭2 h，TRPV1 (1:500)、CGRP 抗体(1:500)一抗4℃孵育过夜，荧光二抗（Alexa Fluor 488 驴抗小鼠，1:400；
Alexa Fluor 647 驴抗兔，1:400）避光孵育2 h，DAPI染核5 min，PBS 洗10 min×3 次后封片，荧光显微镜阅片，Image Pro-Plus 6.0 统计共表达TRPV1/CGRP细胞个数。

6.统计学分析

SPSS 25.0 进行数据统计，计量资料采用均数±标准误(±SEM)表示。多组间比较选用单因素方差分析，方差齐时，两两比较选用LSD 检验，方差不齐时，采用Tamhane"s T2 检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

1.各组小鼠卵巢组织形态学比较

对照组小鼠卵巢组织具有不同阶段发育良好的卵泡；
模型组小鼠卵泡内颗粒细胞层减少，囊性扩张、闭锁卵泡增加；
电针关元组及电针敏化组小鼠对比模型组小鼠卵巢颗粒细胞层数增多，卵泡及黄体发育良好（见图1）。

图1 小鼠卵巢组织形态比较小鼠卵巢组织HE 染色图，蓝色箭头所示为正常卵泡，黄色箭头所示为黄体，红色箭头所示为闭锁卵泡，黑色箭头所示为颗粒细胞层，标尺= 100 μmFig. 1 Comparison of histological morphology of mouse ovarian tissue HE staining of mouse ovarian tissue, blue arrows indicate normal follicles, yellow arrows indicate corpus luteum, red arrows indicate atresia follicles, and black arrows indicate the granulosa cell layer. Scale bar = 100 μm

2.各组小鼠机械痛阈值比较

与对照组比较，模型组关元穴、敏化点痛阈值显著下降(P< 0.01)；
与模型组比较，电针关元组关元穴及敏化点痛阈值显著升高(P< 0.05)、电针敏化组关元穴及敏化点痛阈值显著升高(P< 0.05、P<0.01)；
电针关元组和电针敏化组比较差异无统计学意义（见图2）。

图2 小鼠机械痛阈值比较(n = 8,±SEM)(A)各组小鼠关元穴痛阈值比较；
(B)各组小鼠敏化点痛阈值比较**P< 0.01，与对照组相比；
#P<0.05，##P<0.01，与模型组相比Fig. 2 Comparison of mechanical pain threshold in mice (n = 8,±SEM)(A) Comparison of pain threshold at CV4 acupoint in each group; (B) Comparison of pain threshold at sensitization point in eachgroup.**P<0.01,compared with group control; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group model.

3. 各组小鼠T13-L2 节段脊髓、DRG 组织中TRPV1 及CGRP 蛋白表达比较

与对照组比较，模型组脊髓组织中TRPV1 及CGRP 蛋白表达显著升高(P< 0.05、P< 0.01)、DRG组织中TRPV1 及CGRP 蛋白表达显著升高(P<0.05)；
与模型组相比，电针关元组和电针敏化组脊髓、DRG 组织中TRPV1 及CGRP 蛋白表达显著降低(P< 0.05)；
电针关元组与电针敏化组比较差异无统计学意义（见图3、4）。

图3 小鼠脊髓组织中TRPV1 及CGRP 蛋白表达比较(n = 4,±SEM)(A) TRPV1、CGRP 和β-actin Western blot 条带例图；
(B)各组小鼠脊髓组织中TRPV1 蛋白表达比较；
(C) 各组小鼠脊髓组织中CGRP 蛋白表达比较*P < 0.05，**P < 0.01，与对照组相比；
#P < 0.05，与模型组相比Fig. 3 Comparison of TRPV1 and CGRP protein expression in mice spinal cord tissue (n = 4,±SEM)(A) Representative bands of TRPV1, CGRP and β-actin in Western blot; (B) Comparison of TRPV1 protein expression in spinal cord tissue of mice in each group; (C) Comparison of CGRP protein expression in spinal cord tissue of mice in each group.*P < 0.05, **P < 0.01, compared with group control; #P < 0.05, compared with group model.

4. 各组小鼠T13-L2 节段脊髓、DRG 组织中TRPV1/CGRP 阳性共表达比较

与对照组比较，模型组脊髓、DRG 组织中TRPV1/CGRP 阳性共表达显著升高(P< 0.01、P<0.05)；
与模型组比较，电针关元组及电针敏化组脊髓、DRG 组织中TRPV1/CGRP 阳性共表达显著降低(P< 0.01、P< 0.05)；
电针关元组和电针敏化组比较差异无统计学意义（见图5、6）。

图5 小鼠脊髓组织中TRPV1/CGRP 共表达光密度比较(n = 4,±SEM)(A)小鼠脊髓组织中TRPV1 及CGRP 阳性表达图（免疫荧光染色法），标尺 = 100 μm，绿色标记TRPV1，红色标记CGRP，细胞核用蓝色标记，白色箭头示为TRPV1/CGRP 阳性共表达；
(B) 各组小鼠TRPV1/CGRP 共表达光密度比较**P < 0.01，与对照组相比；
#P < 0.05，##P < 0.01，与模型组相比Fig. 5 Comparison of the optical density of TRPV1/CGRP co-expression in mice spinal cord tissue (n = 4,±SEM)(A) Positive expression of TRPV1 and CGRP in mice spinal cord tissue (immunofluorescence staining method), Scale bar = 100 μm, TRPV1 is marked in green, and CGRP is denoted in red, the nuclei are marked with blue, and white arrows indicate the positive co-expression of TRPV1/CGRP; (B) Optical density comparison of TRPV1/CGRP co-expression in each group of mice.**P < 0.01, compared with group control; #P < 0.05, ##P < 0.01, compared with group model.

PCOS 是一种常见的女性生殖系统疾病，占排卵障碍病人的70%～80%，在不孕症的病因学中起重要作用[14]。无排卵、多囊样卵巢是PCOS 的典型特征，PCOS 小鼠多表现为囊性卵泡数量显著增加、黄体减少[15]。本研究通过对小鼠卵巢组织进行HE染色，发现模型组小鼠卵巢组织囊性扩张、闭锁卵泡明显增加，电针关元组及电针敏化组小鼠卵巢组织颗粒细胞层数增多，卵泡及黄体发育良好。提示成功建立PCOS 小鼠模型，且电针能够改善PCOS小鼠卵巢组织病理形态。

图4 小鼠DRG 组织中TRPV1 及CGRP 蛋白表达比较(n = 4,±SEM)(A) TRPV1、CGRP 和β-actin Western blot 条带例图；
(B) 各组小鼠DRG 组织中TRPV1 蛋白表达比较；
(C)各组小鼠DRG 组织中CGRP 蛋白表达比较*P < 0.05，与对照组相比；
#P < 0.05，与模型组相比Fig. 4 Comparison of TRPV1 and CGRP protein expression in mice DRG tissue (n = 4,±SEM)(A) Representative bands of TRPV1, CGRP and β-actin in Western blot; (B) Comparison of TRPV1 protein expression in DRG tissues of mice in each group; (C) Comparison of CGRP protein expression in DRG tissues of mice in each group.*P < 0.05, compared with group control; #P < 0.05, compared with group model.

图6 小鼠DRG 组织中共表达TRPV1/CGRP 细胞个数比较(n = 4,±SEM)(A) 小鼠DRG 组织中TRPV1 及CGRP 阳性表达图（免疫荧光染色法），标尺 = 100 μm，绿色标记TRPV1，红色标记CGRP，细胞核用蓝色标记，白色箭头示为TRPV1/CGRP 共表达细胞；
(B) 各组小鼠共表达TRPV1/CGRP细胞数量比较*P < 0.05，与对照组相比；
#P < 0.05，与模型组相比Fig. 6 Comparison of the number of cells co-expressing TRPV1/CGRP in mice DRG tissues (n = 4,±SEM)(A) Positive expression of TRPV1 and CGRP in mice DRG tissue (immunofluorescence staining method), Scale bar =100 μm, TRPV1 is marked in green, CGRP is marked in red, nuclei are marked in blue, and white arrows indicate cells that co-express TRPV1/CGRP; (B) Comparison of the number of co-expressing TRPV1/CGRP cells in each group of mice.*P < 0.05, compared with group control; #P < 0.05, compared with group model.

中医认为，腧穴既是针刺治疗疾病的刺激部位，也是疾病的反应部位，具有“按而痛止”“按之快然”的特点。《备急千金要方·灸例》记载：“有阿是之法，言人有病痛，即令捏其上，若理当其处，不问孔穴……灸刺皆验”，表明针刺痛敏点可以明显的缓解病痛。临床研究表明，机体病理状态下，与疾病相关的体表反射区存在痛觉敏化现象，按压这些特殊区域具有疼痛、酸胀等感觉，且压痛点多位于与脏腑相关的体表经络、穴位，具有相对特定联系[16,17]。在动物实验中同样可以观察到内脏疾病引发的痛觉敏化现象[18]。吴强等[19]采用触诊法对143 名卵巢相关疾病病人体表进行按压探查压痛点，发现压痛区域主要分布在下腹部、腰骶、下肢内侧等，与经穴、经脉存在高度相关性。以上研究表明，体表压痛是穴位敏化的主要表现形式之一，疾病状态下腧穴痛阈降低。我们的前期研究[12]发现PCOS 小鼠尾静脉注射EB 后，双下肢内侧、下腹部、腰骶部体表可见蓝色的EB 渗出点，电针EB点重合最多处与同一脊髓节段体表区域的关元穴具有相似效应。为进一步验证穴位敏化现象，本研究对PCOS 小鼠关元穴及敏化点进行痛阈测定，发现机械痛阈值显著低于对照组，PCOS 小鼠关元穴及敏化点具有痛觉敏化。电针能够显著提高其机械痛阈值，进一步验证了穴位的开/合功能是“活的”，并伴随内脏病理生理变化而动态改变。

机体病变时，相应体表多出现神经源性炎性病理改变，特殊部位从“静息态”到“激活态”动态转变，TRPV1、CGRP 等受体在敏化点的高表达可能是体表敏化的物质基础[20]。TRPV1、CGRP 在神经性疼痛中起关键作用，不仅参与痛觉过敏，还可调控疼痛[21]。TRPV1 在机体遭受有害刺激后激活，同时释放CGRP、P 物质等伤害性神经肽，引发神经源性炎症导致外周敏化[22]。CGRP 是对伤害性传递至关重要的一种神经肽，与神经源性炎症的发展密切相关[23]。TRPV1 介导的CGRP 释放可加强TRPV1 在疼痛感觉中的作用，TRPV1 和CGRP之间存在相互作用关系[24]。研究表明PCOS 能显著增加血浆CGRP 及卵巢中CGRP 阳性神经纤维的表达[25]，CGRP 的过量释放可通过感觉神经末梢引起穴位致敏，针灸能够减少CGRP、肿瘤坏死因子α、白介素6 的释放进而降低TRPV1 敏感性及表达水平[26]，通过调节TRPV1 离子通道降低PCOS病人中性粒细胞的氧化应激和Ca2+浓度，从而改善PCOS 病人炎症症状[27]。以上研究提示CGRP、TRPV1 参与了PCOS 的病理生理过程。PCOS 小鼠EB 点主要集中于T13-L2脊髓节段支配的体表区域，具有神经源性炎性反应[12]。内脏伤害性信息经DRG传入脊髓背角，经背根反射传至外周引发EB 渗出，TRPV1、CGRP 阳性细胞在敏化穴区高度表达[28]。神经源性炎性反应中最易产生敏化现象，脊髓背角的伤害感受神经元随着机体病理变化而动态改变，外周伤害性刺激的传入可引发可塑性变化[29]。在炎症疼痛大鼠模型中，DRG 组织中CGRP 阳性神经元与TRPV1 部分重叠，TRPV1 激活参与CGRP表达的上调[30]。在本研究中，与对照组比较，模型组T13-L2节段脊髓、DRG 组织中TRPV1、CGRP表达水平及TRPV1/CGRP 共表达光密度均显著升高，表明TRPV1 通道激活、CGRP 释放增加，引起体表机械痛阈降低，穴位敏化反应。电针可显著降低脊髓、DRG 组织中TRPV1、CGRP 表达水平及TRPV1/CGRP 阳性共表达，表明TRPV1、CGRP 参与PCOS 小鼠的穴位敏化部分机制，关元穴及敏化点压痛敏化可能与T13-L2节段脊髓、DRG中TRPV1、CGRP 表达显著升高有关；
随着电针改善PCOS 小鼠卵巢组织病理形态，关元穴及敏化点痛阈值显著升高，T13-L2节段脊髓、DRG 组织中TRPV1、CGRP 表达显著下降，进一步说明穴位敏化和内脏功能有关，电针可通过下调脊髓、DRG 组织中TRPV1、CGRP 的异常高表达，调节PCOS 小鼠体表敏化现象。电针EB 点重合最多处与同一脊髓节段体表区域的关元穴具有相似效应，穴位不是一个简单的反应点，而是一块动态功能区域。

综上所述，电针敏化点与关元可改善PCOS 小鼠卵巢组织病理形态，降低PCOS 小鼠T13-L2节段脊髓、DRG 组织中TRPV1、CGRP 的异常高表达，进而提高关元穴及敏化点的机械痛阈值，调节穴位痛觉敏化反应，说明TRPV1、CGRP 参与PCOS 小鼠模型的穴位敏化部分机制。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。

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