基于生物信息学的乳腺癌关键基因筛选及实验验证

梁 霄，李娅兰，白皓天，杨 婧，王 锐

（1. 黑龙江中医药大学药学院，黑龙江 哈尔滨 150040；
2. 黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

乳腺癌（breast cancer，BRCA）是全球范围内3种最常见的恶性肿瘤之一，极大程度上影响世界人民的身心健康，乳腺癌的死亡率居女性各类恶性肿瘤之首且早期乳腺癌的发病率从7%～18%不等［1］。目前乳腺癌治疗包括手术、放射治疗、化疗、激素以及靶向治疗在内的局部治疗和全身治疗［2，3］。约70%～80%的早期乳腺癌患者可以被治愈，但部分乳腺癌的治疗方法由于肿瘤细胞的侵袭性并没有提高生存率反而给患者带来了心里压力，放疗过程中在杀死肿瘤细胞的同时也会干扰正常细胞的生存，给患者带来二次伤害。此外，由于乳腺癌细胞的特异性导致其治疗结果存在很大的个体差异。从分子水平上讲，人表皮生长因子受体2（HER2）的激活、激素受体的激活以及BRCA 突变均是病因所在。尽管已经有学者对其分子机制进行了探究，但目前仍存在着不为人知的方面［4］。因此研究乳腺癌发病机制以及乳腺癌的相关基因，对于乳腺癌的早期诊断以及治疗发挥着积极作用，有效缓解目前临床乳腺癌治疗的现状。近年来，基于基因芯片，通过数据筛选、统计化分析、通路分析和蛋白互作网络可视化分析整合海量的生物学信息的生信分析技术得到了广泛应用［5，6］。并且被应用于癌症研究的生物信息学技术占据着很大比例，通过生物信息技术可以从分子层面进一步探索乳腺癌的发病机制。

本文利用基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）对乳腺癌基因芯片进行检索，筛选出乳腺癌模型组与对照组在表达上存在差异的基因，进而对差异基因进行基因本体功能分析和京都基因与基因组百科全书通路分析，进一步构建差异基因PPI 蛋白互作网络，筛选并明确关键基因及其差异表达、预后分析以及免疫浸润情况。最后将差异基因转换为探针列表，导入Connectivity Map（CMap）筛选潜在化合物，并对核心基因及潜在治疗药物进行体外验证。为乳腺癌的临床治疗提供更多的选择，为结合生信分析和基因芯片探究乳腺癌的分子机制和潜在治疗药物提供研究的新思路。

1.1 数据获取

在基因表达数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中输入检索并下载“BRCA”的GSE79586基因表达谱。检索所得GSE79586 基因表达谱基于Affymetrix GPL19057 平 台（Affymetrix Illumina NextSeq 500）。其中包含18 个乳腺癌样本和18 个正常对照样本，共36 个样本。

1.2 数据处理及筛选

将下载的样本数据进行分组并重命名分为乳腺 癌 组 和 对 照 组，导 入BioJupies（https：//amp.pharm.mssm.edu/biojupies/）处理并筛选差异基因。将经过处理数据进行下一步处理以识别差异基因（DEGs）。主成分分析（PCA）是一种用通过正交变换将原始数据变换为另一组无线性相关的变量，以实现数据降维的目的。它通常用于一组数据主要特征分量的提取［7］。差异基因的筛选条件设置为|log2 Fold Change|≥2 且校正后P＜0.05。

1.3 差异基因的功能及通路分析

包括生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC） 3 大类在内的GO 分析是大规模功能富集研究中被广泛应用的的方法。KEGG 是一个整合了大量关于基因组、生物途径、疾病方面数据的综合数据库。使用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/），对本研究中所筛选的差异基因进行GO注释分析和KEGG 途径富集分析。其中P＜0.05，基因计数＞5 记作GO 分析中的筛选条件；
P＜0.05记作KEGG 通路分析的筛选条件。

1.4 差异基因表达的可视化处理

L1000FWD 数据库（https：//maayanlab.cloud/l1000fwd/）为16 000 多种药物和小分子诱导基因表达特征提供了交互式可视化，并且支持通过不同属性（如细胞类型、时间点、浓度）以及药物属性对特征进行着色，从而对小分子功能与药物作用方式进行分析，以推断药物对上述差异基因之间的亲和力［8］。将所得药物数据根据相似程度得分由高到低进行排列。

1.5 PPI 互作网络的构建

String 数据库（https：//string-db.org/）是一个可以对差异基因之间的相互作用关系进行可视化分析的在线分析网站。将本研究筛选得到的差异基因导入String 数据库进行蛋白互作关系网络分析，设置置信度（high confidence：0.700），隐藏游离节点，得到基因互作网络。进一步筛选出与乳腺癌相关性较大的蛋白用于后续研究分析。

1.6 关键基因的预后分析

GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）是一款新开发的用于肿瘤和正常基因表达分析和交互分析的交互式网络服务器，由成千上万种肿瘤和正常组织样本数据构成［9］。本研究通过GEPIA 比较分析肿瘤和正常组织基因的差异表达，病理阶段分析，最后通过使用Kaplan-Meier plotter（http：//kmplot. com/analysis/index. php？ p=service&canc er=liver_rnaseq）在线绘图工具对前文所筛选的乳腺癌患者体内核心基因的mRNA 表达情况进行预后分析，一般认为P＜0.05 有显著差异［10］。

1.7 基因相关功能预测

GeneMANIA（http：//www.genemania.org）是一个可以搜索许多大型的、可公开获得的生物数据集来寻找相关基因的网站。这些包括蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA 和遗传相互作用、途径、反应、基因和蛋白质表达数据、蛋白质结构域和表型筛选概况［11］。本研究通过将所筛选的核心基因导入此平台，进而分析所筛选关键基因的功能并推断其价值。

1.8 基因与细胞免疫浸润关系

TIMER2.0 （http：//timer.cistrome.org/）使用6种最先进的算法，能够更加全面、灵活地为癌症基因组图谱（TCGA）或用户提供的肿瘤图谱提供更可靠的免疫浸润水平估计。TIMER2.0 web 服务器提供了分析肿瘤浸润免疫细胞并将其进一步可视化展示的功能，通过将所筛选的关键基因输入数据库所生成的散点图，能够直观地观察其表达以及与乳腺癌免疫浸润水平的关系［12］。

1.9 CMap 分析

CMap（Connectivity Map）是药物基因组学研究领域的重要数据库（https：//portals.broadinstitute.org/cmap/），共收录了1 300 多种化合物，其可通过基因表达谱所建立的基因、疾病与药物的关联性快速利用基因表达谱数据比对出与疾病高度相关的药物，归纳出药物分子可能的作用机制，进而揭示疾病基因与潜在化合物之间的关系［13，14］。将上述筛选差异基因经R 语言处理后转换为对应探针列表，上传CMap 数据库将差异基因列表与数据库参考数据集进行对比，进而筛选潜在化合物。

1.10 细胞实验验证

1.10.1 主要材料 人乳腺癌细胞MDA-MB-436 由黑龙江中医药大学基础医学院提供；
吉非替尼（国药准字J20180014，阿斯利康制药有限公司）；
DMEM 培养基（批号C11995500BT，美国Gibco 公司）；
胎牛血清（批号C0230，Bovogen 公司）；
Trizol（ 批 号 10296028）；
UltraPure Agarose（ 批 号16500100）；
SuperScript Ⅲ RT 逆 转 录kit（批 号11752050）；
Sybr qpcr mix（批号4472920）均购自于美 国 Invitrogen 公 司 ；
H2AFJ 抗 体（ 批 号GTX53601，美国GeneTex 公司）；
TFF1 抗体（批号5893-100，美国Biovision 公司）；
GAPDH 抗体（批号5174P）、HRP 山羊抗兔抗体（批号7074）、HRP 山羊抗鼠抗体（批号91196S）均购自于Cell Signaling Technology；
ECL 检测试剂盒（批号D412DA0006，上海生工生物工程技术服务有限公司）。

1.10.2 仪器 细胞培养箱（德国MMM Group 公司）；
Legend Micro 21R 型台式高速冷冻离心机（美国Thermo 公 司）；
StepOne Software 型 荧 光 定 量PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）；
DYY-6C型电泳仪、DYCZ-24K 型转印电泳仪、WD-9413B 凝胶成像系统均购自于北京六一公司。

1.10.3 RT-PCR 检 测H2AFJ、TFF1 mRNA 表 达水平 将MDA-MB-436 细胞经不同浓度舒尼替尼（0、10、15、20 μmol/L）处理24 h 后，Trizol 法提取细胞总RNA，以总RNA 的浓度及纯度为指标进行质量检测，将RNA 逆转录合成cDNA，进行RT-PCR分析，检测H2AFJ、TFF1 mRNA 的表达水平。反应结束后，PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳和自动凝胶成像分析系统扫描成像。以目标基因与内参基因的电泳条带的密度值的比值作为mRNA 的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.10.4 Western blot 法 检 测H2AFJ、TFF1 蛋 白 表达水平 将MDA-MB-436 细胞经不同浓度舒尼替尼（0、10、15、20 μmol/L）处理24 h 后，加入蛋白裂解液进行裂解收集蛋白样品，经10% 或12%SDS-PAGE 电泳分离蛋白样品，转膜至5%脱脂奶粉中摇晃封闭，加入H2AFJ（1∶1 000 稀释）、TFF1（1∶1 000 稀释）一抗，4 ℃孵育12 h，TBST 洗膜后加入二抗（1∶2 000 稀释）室温孵育1 h，随即将膜用TBST 溶液洗3 次，ECL 试剂盒显色、成像并拍照，最后用Image J 软件分析蛋白条带并计算灰度值。

1.10.5 统计学处理 采用GraphPad 8.0.2 软件进行数据的统计与分析，计量数据以（±s）表示，单因素方差分析用于组间比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2.1 差异基因筛选结果

PCA 可视化分析结果显示出数据的前3 个主要成分（PC1，PC2，PC3）的交互式三维散点图，每个点代表一个所选RNA-seq 数据样品。从图1 可以看出，在三维空间中具有相似基因表达谱的样品间的距离更加接近，并且对照组与模型组的表达相互独立，可用于下一步分析。以P＜0.05 为条件筛选得到差异表达基因，Log2FC 值＞2 输出为上调基因，Log2FC＜-2 输出为下调基因，共筛选到包括1 786 个上调基因和2 130 个下调基因在内的3 916 个差异表达基因，可视化结果以火山图及聚类图方式体现（图2）。

图1 PCA 分析结果示意图Fig 1 Schematic diagram of PCA analysis results

图2 差异基因火山图及聚类热图Fig 2 Differential gene volcano map and cluster heat map

2.2 GO 功能富集和KEGG 通路分析

运用DAVID 在线网站对本研究中3 916 个差异基因进行GO、KEGG 分析并将结果进行可视化。GO 富集分析显示，差异基因主要富集的生物过程（BP）为以磷酸化的正向调控，磷酸腺苷激酶活性的阳性调节，细胞外基质组织，蛋白质磷酸化的正调控，细胞增殖调节等为主。对差异基因组分分析（CC）主要集中在分泌囊泡，双细胞紧密连接，粘着斑，细胞质囊，内质网腔等。差异基因的分子功能（MF）分析为外消旋酶和差向异构酶活性，肌球蛋白V 结合，三磷酸酶结合，蛋白激酶活性，蛋白质同二聚化活性。KEGG 通路分析结果显示，差异表达基因主要富集的通路与系统性红斑狼疮，酒精中毒，粘着斑，阿米巴痢疾等病症和Ras 信号通路等过程有关，各通路富集过程及联合评分如表2、图3所示。

图3 差异基因GO 功能富集分析结果Fig 3 Results functional GO enrichment analysis of differential gene

表2 KEGG 通路分析Tab 2 KEGG pathway analysis

2.3 差异基因特征表达的交互性可视化结果

将差异基因导入L1000FWD 在线数据库后，得到小分子与药物特征相似度结果，如表3 所示，MEK 抑制剂、HSP90 抑制剂、信号转导通路激酶抑制剂等是与差异基因具有特征相似的药物。数据经可视化处理后以烟火图形式展现，其中不同的形状代表不同的时间节点，不同的颜色代表不同的细胞类别。如图4。

图4 差异基因特征表达可视化烟火图Fig 4 Visual pyrotechnic map of the expression of differentially expressed genes

表3 与差异基因特征相似的主要药物Tab 3 Main drugs with similar characteristics with different genes

2.4 差异基因PPI 网络可视化结果

运用String 数据库对所获取的差异基因进行蛋白互作网络分析，得到PPI 网络图谱。该图谱由140 个节点以及126 条连线组成（剔除掉无关节点），如图5 所示。可以看出，与乳腺癌发生发展较为密切的基因主要为H2AFJ、TFF1、GATA3、FOXA1、CDH1 等。

图5 差异基因蛋白互作网络图Fig 5 Network diagram of differential gene protein interaction

2.4 关键基因H2AFJ 和TFF1 的表达情况分析

利用GEPIA 数据库，比较BRCA 和正常乳腺癌细胞组织中H2AFJ 与TFF1 的mRNA 表达，结果如图6 所示。H2AFJ 与TFF1 在乳腺癌细胞组织中的表达水平高于正常组织。由H2AFJ 与TFF1 的表达差异与乳腺癌患者病理分期之间的相关性结果可知，H2AFJ 与TFF1 组均具有统计学意义（P＜0.05）。如图7 可知，H2AFJ 与TFF1 中心位点未在同一条中轴线上，并且在第四、五阶段出现显著变化。据此可推测H2AFJ 与TFF1 在乳腺癌的此阶段进展中发挥着重要作用。

图6 乳腺癌细胞患者H2AFJ 与TFF1 的表达Fig 6 Expression of H2AFJ and TFF1 in breast cancer cells

图7 乳腺癌患者H2AFJ 与TFF1 表达与肿瘤分期的相关性研究Fig 7 Correlation between the expression of H2AFJ and TFF1 and tumor stage in breast cancer patients

2.5 乳腺癌患者H2AFJ 与TFF1 表达的预后价值

H2AFJ 与TFF1 表达在乳腺癌过程中的价值通过采用GEPIA 进行评估以进一步分析H2AFJ、TFF1 与临床结果之间的相关性。H2AFJ 与TFF1总 生 存 率（overall survival， OS）和 无 病 生 存 率（Disease-free survival， DFS）曲线分别如图8A、B 所示。结果显示，H2AFJ（P=0.008 5）与TFF1（P=0.003 1）都与短期无病生存率呈显著相关（P＜0.05）。

图8 乳腺癌细胞中H2AFJ 与TFF1mRNA 表达的预后价值Fig 8 Prognostic value of H2AFJ and TFF1mRNA expression in breast cancer cells （GEPIA）

2.6 差异基因功能分析预测结果

将基因H2AFJ 与TFF1 依次输入GeneMIANA 网络数据库进行可视化得到互作网络图，如图9 所示。图9 反映出H2AFJ 与TFF1 差异表达基因的功能以及二者相似基因的功能以及所筛选基因与其相似基因功能上相似的部分，主要与激素受体结合、上皮结构维持、核糖核酸聚合酶II 特异性脱氧核糖核酸结合转录因子结合和基因表观遗传负调控、基因沉默、参与转录负调控的染色质组织等过程相关。其中物理相互作用、基因相互作用以及通路的所占比例分别为76.59%、3.17%、1.88%。

图9 H2AFJ 与TFF1 及其相似基因功能聚类分析Fig 9 Cluster analysis of h2afj， TFF1 and their similar genes

2.7 乳腺癌患者H2AFJ与TFF1 的免疫细胞浸润

采用TIMER2.0 数据库探究H2AFJ 与TFF1与免疫细胞浸润之间的相关性，将H2AFJ 与TFF1输入数据库中，结果如图10～11 所示。TFF1 的表达与乳腺癌中CD8+T 淋巴细胞、单核细胞的浸润存在显著的正相关，与CD4+T 淋巴细胞、中性粒细胞的浸润呈显著负相关，而与B 细胞、巨噬细胞无显著相关性。H2AFJ 的表达与乳腺癌中B 细胞呈正相关，与CD8+、CD4+、巨噬细胞、中性粒细胞呈负相关，与单核细胞无显著相关性。

图10 H2AFJ 与免疫细胞浸润相关性Fig 10 Correlation between H2AFJ and immune cell infiltration

2.8 CMap 分析

CMap 中的Score 值得分范围在-1～1 之间，分析结果分值为正表示该药物对疾病发展具有促进作用，二者之间呈正相关；
分析结果分值为负表示该药物对疾病的发展具有抑制作用，二者之间呈负相关；
分值绝对值越大则表明药物与疾病间的相关性越高、百分比越大表明药物的抑制作用越强［15］。将经R 语言处理后的差异基因探针列表导入至CMap 数据库，筛选出分值为负且关联强度最大的5个化合物，具体信息如表4 所示。包括吉非替尼、阿培利西、索拉菲尼（Sorafenib）、舒尼替尼、依维莫司等在内的化合物对乳腺癌基因表达具有抑制作用。

表4 CMap 列表中乳腺癌的前5 种潜在治疗药物Tab 4 The top 5 potential therapeutic drugs for breast cancer in CMAP list

2.9 乳腺癌中H2AFJ、TFF1 mRNA 表达分析

为了进一步验证数据挖掘结果，本实验利用RT-PCR 检测了不同浓度的吉非替尼处理人乳腺癌细 胞MDA-MB-436 后H2AFJ、TFF1 mRNA 的 表达变化，见图12。与对照组比较，吉非替尼各剂量组H2AFJ、TFF1 mRNA 表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图12 吉非替尼对MDA-MB-436 细胞中H2AFJ、TFF1 mRNA 表达的影响Fig 12 Effect of gefitinib on the expression of H2AFJ and TFF1 mRNA in MDA-MB-436 cells

图11 TFF1 与免疫细胞浸润相关性Fig 11 Correlation between TFF1 and immune cell infiltration

2.10 乳腺癌中H2AFJ、TFF1 蛋白表达分析

不同浓度的吉非替尼处理人乳腺癌细胞MDA-MB-436 后H2AFJ、TFF1 蛋白表达变化见图13，与对照组比较，吉非替尼各剂量组H2AFJ、TFF1 mRNA 表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图13 吉非替尼对MDA-MB-436 细胞中H2AFJ、TFF1 蛋白表达的影响Fig 13 Effects of gefitinib on the expression of H2AFJ and TFF1 proteins in MDA-MB-436 cells

乳腺癌有LuminaA、LuminaB、Her2 和Basal 亚型等几种类型，是一种复杂、异质的疾病，同时也是全世界妇女中最常见浸润性癌症，尽管在近代研究中，乳腺癌的总体存活率有了大幅度提高，但是它仍然是导致女性死亡的主要原因之一［16］。癌症的发生发展与基因突变具有很大的关联，近年来，随着基因治疗策略的兴起，越来越多的原癌基因及抑癌基因被测试为癌症治疗的新靶点，基因的变化也同样在在乳腺癌的发展过程中发挥着重要作用［17］。因此从基因角度研究乳腺癌的发病机制具有十分重要的意义。而生物信息学正是从基因这一层面探索包括癌症在内的各类疾病的发病机制，为进一步探索研究乳腺癌的发生机制以及确定新的更有效的靶点提供了一种新方法，同时也为临床上发明乳腺癌的治疗方法进行补充。

本研究利用GEO 数据库的GSE79586 基因芯片对乳腺癌组织与正常组织的差异化表达基因进行生物信息学分析，共筛选出包括1 786 个上调基因和2 130 个下调基因共3 916 个差异表达基因。通过GO 功能分析和KEGG 通路分析，明确差异基因参与的富集功能和通路，同时构建PPI 蛋白互作网络，进行可视化分析，明确与乳腺癌细胞密切相关的核心基因H2AFJ 与TFF1，Yao 等［18］对一组乳腺肿瘤进行基因阵列比较，在乳腺癌和细胞系中通过定量聚合酶链反应和荧光原位杂交证实了候选位点的扩增，结果发现，在所选基因总只有H2AFJ在具有12p13 扩增的乳腺癌中过度表达，H2AFJ 为乳腺癌中新推定的癌基因。TFF1 是三叶因子家族结构域蛋白TFF 家族中的一员，主要在胃上皮中组成性表达，TFF1 基因是TFF 家族中第一个被鉴定的哺乳动物成员，Siu［19］等利用显微镜和流式细胞仪进行分析，证实了TFF1 与乳腺癌细胞MCF-7 细胞膜密切相关，TFF1 基因可能是乳腺癌的潜在基因。进一步通过GEPIA、GeneMANIA、TIMER2.0 等数据库，明确H2AFJ 与TFF1 的差异表达、预后价值以及免疫细胞的浸润情况。结果显示H2AFJ 与TFF1mRNA 在乳腺癌细胞中较正常组织中表达显著，可能是乳腺癌患者生存的潜在预后标志物。随后利用CMap 筛选潜在化合物，为乳腺癌的临床防治提供候选治疗药物。结果显示，阿培利西通过抑制PI3K 酶亚基编码蛋白，靶向乳腺癌的磷脂酰肌醇-3-激酶催化PIK3CA 基因突变，对女性晚期或转移性乳腺癌患者治疗以及预后有重大作用，可以显著延长乳腺癌患者无疾病生存期［20，21］。舒尼替尼和索拉菲尼都是属于小分子络氨酸酶抑制剂，是多靶点抗血管生成TKIs，作用于血管内皮生长因子受体、血小板源生长因子受体等。有研究显示它们均与乳腺癌的预后明显相关，并且可以促进乳腺癌模型的转移［22，23］。单独应用索拉菲尼临床疗效达不到预期值，现在多采用索拉菲尼联合化疗药物对晚期乳腺癌进行治疗，索拉菲尼联合紫衫醇一线治疗晚期乳腺癌的疾病控制情况就优于单纯的紫杉醇联合安慰剂。其中，吉非替尼是CMap 分析中相关性平分最高的治疗乳腺癌的潜在治疗药物，故本研究后续选择吉非替尼用于后续体外实验以验证所筛选的核心基因在乳腺癌中的表达。研究结果证实了吉非替尼对于乳腺癌治疗的有效性。因此包括吉非替尼、舒尼替尼、阿培利西等在内的潜在化合物有望成为乳腺癌的潜在治疗药物。

综上所述，本实验运用生物信息学结合基因芯片，探究乳腺癌的差异表达基因，并对其进行初步分析，得到差异基因主要参与的信号通路及其功能，进一步挖掘其潜在治疗药物并通过体外实验验证了所筛选的潜在治疗药物及核心基因。研究结果进一步证实，潜在治疗药物吉非替尼可有效抑制乳腺癌MDA-MB-436 细胞中核心基因H2AFJ 与TFF1 的表达，为未来乳腺癌的临床治疗和机制研究提供理论依据。

作者贡献度说明：

梁霄：负责靶点筛选、通路富集、网络构建、CMap 药物筛选、数据可视化处理及实验部分；
李娅兰、白皓天：负责文献查阅及整理；
王锐、杨婧：提供设计思路。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

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