雷帕霉素灌胃对糖尿病大鼠视网膜的保护作用及机制
时间：2023-06-15 09:35:21 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
哈利，王琴，杨烨
1 深圳市龙华区中心医院急诊内科，广东深圳 518110；
2 新疆医科大学第二附属医院老年病科干部病房
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病最常见的并发症之一，主要表现为微血管病变，是糖尿病患者致盲的潜在危险因素之一。研究显示，罹患2 型糖尿病8 年后，50%的患者会发生DR，20 年后则有超过77%的患者发生DR［1］。目前DR 的治疗方法多为控制血糖、降低血脂、激光治疗等，虽然对视力损害起到一定治疗作用，但仍缺少根治DR 的特效药物。磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路是调控细胞自噬的重要信号通路，在细胞生长、增殖、分化和凋亡过程中具有非常重要的作用［2］。研究显示，PI3K/AKT/mTOR 信号通路在糖尿病及其并发症中起关键作用［3］。雷帕霉素是mTOR 特异性抑制剂，对癌症、代谢性疾病均具有一定的药理作用［4］。本研究通过建立2 型糖尿病大鼠模型，使用雷帕霉素进行干预治疗，以PI3K/AKT/mTOR 信号通路为靶点，观察雷帕霉素对糖尿病大鼠视网膜的保护作用。
1.1 材料
1.1.1 实验动物 成年雄性SPF 级SD 大鼠50 只，体质量180～220 g，由新疆医科大学动物实验中心提供。动物使用许可证SCXK（新）2016-0002。饲养于SPF 级实验室，室温21～23 ℃，湿度50%～60%，12 h/12 h 光暗周期循环。本实验严格遵守动物福利与伦理要求，并通过新疆医科大学动物实验中心伦理委员会批准（批号20190531-08）。
1.1.2 主要试剂与仪器 雷帕霉素、链脲佐菌素（STZ）由北京索莱宝科技有限公司提供；
二甲双胍为中美上海施贵宝制药有限公司产品；
兔抗PI3K/AKT/mTOR 一抗为Abcam 公司产品；
山羊抗兔HRP标记二抗、GAPDH 内参蛋白为Bioswamp 公司产品。低速冷冻离心机（KDC-2046）、高速冷冻离心机（HC-3018R）、酶标仪（Varioskan Flash）、血糖仪及配套试纸（拜安捷2）。
1.2 动物分组与糖尿病模型制备 将大鼠随机分为正常对照组10 只和模型组40 只。正常对照组给予普通饲料喂养。糖尿病组给予高脂高糖饲料喂养4 周后，腹腔一次性注射35 mg/kg STZ，注射后第3 天采集空腹尾静脉血，以随机血浆葡萄糖≥11.1 mmol/L、食量及饮水量增加、尿量增多为造模成功。
1.3 药物干预方法 取造模成功的30 只大鼠，随机分为模型对照组、阳性对照组、雷帕霉素组各10 只。阳性对照组给予二甲双胍20 mg/（kg·d）灌胃，雷帕霉素组给予雷帕霉素1 mg/（kg·d）灌胃，模型对照组与正常对照组给予同等体积纯净水灌胃，连续4周。
1.4 空腹血糖检测 大鼠麻醉，采集空腹尾静脉血，使用血糖仪检测血糖水平。
1.5 视网膜病理检查 采用HE 染色法。大鼠处死，取左侧视网膜组织，4%多聚甲醛固定24 h，75%乙醇脱水，石蜡包埋，HE 染色，400 倍显微镜下观察病理改变。每张切片随机选取20个固定面积（不重叠视野），分别计数视网膜神经节细胞个数，取平均值，用来评价视网膜病变程度。
1.6 视网膜组织中PI3K/AKT/mTOR 表达检测 采用Western blotting 法。取大鼠右侧视网膜组织，加入裂解液制备组织匀浆，采用考马斯亮蓝法测定蛋白上清中总蛋白含量。加入1×PBS 和4×Loading Buffer 稀释蛋白，100 ℃水浴20 min 使蛋白变性。使用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，然后将蛋白转印至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入兔抗鼠一抗（PI3K、AKT、mTOR、内参GAPDH 稀释比例分别为1∶3 000、1∶200、1∶1 000、1∶3 000），4 ℃摇床孵育。TBST 洗膜，加入山羊抗兔二抗（稀释比例为1∶3 000）孵育2 h。TBST 洗膜，ECL 化学发光液显色，Image Lab曝光条带，Image J软件分析目标条带的灰度值。以GAPDH 作为内参，计算目标蛋白的相对表达量。
1.7 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。采用Shapiro-Wilk法进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组用药前后空腹血糖水平比较 各组用药前空腹血糖水平比较差异均无统计学意义（P均＞0.05）。用药后与正常对照组比较，模型对照组、阳性对照组及雷帕霉素组空腹血糖均升高（P均＜0.05）；
与模型对照组比较，阳性对照组和雷帕霉素组空腹血糖均降低（P均＜0.05）。见表1。
表1 各组用药前后空腹血糖比较（mmol/L， ± s）
表1 各组用药前后空腹血糖比较（mmol/L， ± s）
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；
与模型对照组比较，#P＜0.05；
与阳性对照组比较，△P＜0.05。
组别正常对照组模型对照组阳性对照组雷帕霉素组n 10 10 10 10空腹血糖用药前5.06 ± 0.87 5.19 ± 0.98 5.24 ± 1.12 5.30 ± 1.05用药后5.54 ± 1.25 21.08 ± 5.46*18.27 ± 4.60*#16.15 ± 5.05*#
2.2 各组视网膜组织病理形态比较 正常对照组视网膜形态无明显病理改变；
模型对照组视网膜形态改变，细胞水肿严重，神经节细胞核染色质深染加重，可见大量空泡变性的细胞，外层和内层结构紊乱，界限模糊不清，视网膜全层明显变薄；
阳性对照组视网膜细胞水肿，核质染色深染，各层结构紊乱，视网膜全层变薄；
雷帕霉素组视网膜细胞轻度水肿，厚度稍变薄，神经节细胞层内外层排列稍紊乱，细胞间隙增大，有少量核固缩，染色加深，大量节细胞空泡变性，细胞数量稍微减少。
2.3 各组视网膜神经节细胞计数比较 正常对照组、模型对照组、阳性对照组、雷帕霉素组视网膜神经 节 细 胞 数 分 别 为（24.56 ± 1.66）、（17.40 ± 1.06）、（19.07 ± 1.03）、（20.13 ± 0.96）个。与正常对照组相比，模型对照组、阳性对照组及雷帕霉素组视网膜神经节细胞计数均降低（P均＜0.05），与模型对照组相比，阳性对照组及雷帕霉素组视网膜神经节细胞计数均升高（P均＜0.05），雷帕霉素组高于阳性对照组（P＜0.05）。
2.4 各组视网膜PI3K、AKT、mTOR 表达水平比较 与正常对照组相比，模型对照组、阳性对照组及雷帕霉素组PI3K、AKT表达水平降低，mTOR表达水平升高；
与模型对照组相比，阳性对照组与雷帕霉素组PI3K、AKT 表达水平升高，mTOR 表达水平降低；
与阳性对照组相比，雷帕霉素组AKT 表达水平升高、mTOR表达水平降低（P均＜0.05）。见表2。
表2 各组视网膜PI3K、AKT、mTOR蛋白表达比较（± s）
表2 各组视网膜PI3K、AKT、mTOR蛋白表达比较（± s）
注：与正常对照组比较，*P＜0.05；
与模型对照组比较，#P＜0.05；
与阳性对照组比较，△P＜0.05。
组别正常对照组模型对照组阳性对照组雷帕霉素组n 10 10 10 10 PI3K 0.751 ± 0.105 0.454 ± 0.086*0.544 ± 0.082*#0.587 ± 0.099*#AKT 0.843 ± 0.134 0.223 ± 0.067*0.425 ± 0.060*#0.632 ± 0.082*#△mTOR 0.371 ± 0.058 0.724 ± 0.037*0.635 ± 0.059*#0.582 ± 0.064*#△
DR是糖尿病主要的眼部并发症，按照病变严重程度可分为早期非增殖性DR 和中晚期增殖性DR。目前全世界已有9 300万DR患者，其中1 700万为增殖性DR［5］。DR 的发病机制目前尚不明确，AGEs 聚集、蛋白激酶C信号通路阻碍、多元醇通路代谢异常等对DR 的发生发展均有促进作用［6］。目前治疗DR的方法主要针对晚期阶段的增殖性DR，且效果有限。雷帕霉素是一种具有广泛抑制增殖作用的大环内酯类抗生素，可特异性抑制mTOR，用于癌症、代谢性疾病的治疗已取得一定效果。抑制mTOR 活性是雷帕霉素改善2型糖尿病胰岛素抵抗并降低血糖的机制之一。动物实验显示，雷帕霉素可降低糖尿病小鼠的血糖水平，提高小鼠对胰岛素的敏感性［7］。mTOR/S6K1 可被胰岛素信号激活，通过增加IRS-1丝氨酸残基磷酸化，促使IRS-1 与胰岛素受体解离，引起胰岛素抵抗［8］。本研究结果显示，给予雷帕霉素治疗4周后，糖尿病大鼠血糖明显降低，表明雷帕霉素能够对糖尿病大鼠的血糖起到一定的控制作用。
DR 是糖尿病慢性并发症之一，以视网膜屏障通透性增加、血管内皮细胞和周细胞减少、血管基底膜增厚、毛细血管闭塞、视网膜神经元和胶质异常为主要病理改变。在高血糖状态下，视网膜神经细胞极易受到损伤，导致视网膜神经保护作用受损。本研究结果显示，与正常对照组比较，模型对照组视网膜病理改变严重，神经节细胞数量下降明显，而与模型对照组相比，阳性对照组及雷帕霉素组视网膜虽同样出现病理改变，神经节细胞数量下降明显，但较模型组更轻，与阳性对照组相比，雷帕霉素组视网膜病理改变则更轻。王菲菲［9］对高眼压模型SD 大鼠使用雷帕霉素滴眼液后，发现雷帕霉素降低了大鼠的眼压，同时减弱了大鼠视网膜组织及视网膜神经节细胞损伤，结合本次研究结果可见，雷帕霉素大鼠的视网膜组织及视网膜神经节细胞确有一定的保护作用，同时能够对DR 大鼠起到一定的治疗作用。
PI3K/AKT 是重要的细胞内传导通路，具有控制细胞生长、增殖与凋亡的作用。PI3K/AKT 广泛存在于细胞中，在糖尿病的发生发展过程中发挥重要作用［10］。研究显示，糖尿病时的低氧和低血糖可以诱导血管内皮生长因子过度表达，通过fms 样酪氨酸激酶受体和胎肝激酶受体这两个酪氨酸激酶家族的特异性受体，激活PI3K 信号通路，引起过度的血管生成，从而导致DR 和糖尿病肾病［1］。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型对照组视网膜组织中PI3K、AKT 表达水平均下降；
与模型对照组相比，阳性对照组和雷帕霉素组PI3K、AKT 表达水平均升高，其中雷帕霉素组AKT 表达水平高于阳性对照组，表明糖尿病与PI3K/AKT 信号通路受到抑制存在一定的关联，而雷帕霉素可能通过上调AKT 表达水平改善糖尿病大鼠血糖水平及视网膜受损程度。
mTOR 是PI3K/AKT 信号通路下游重要的丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶，AKT可以直接磷酸化mTOR，激活mTOR 及下游信号通路，发挥生物学功能，其主要功能为促进物质代谢、参与细胞凋亡、自噬的功能等，在2 型糖尿病、肥胖、癌症等疾病的发生发展过程中发挥重要作用［11-12］。研究显示，mTOR在胰岛素代谢过程中具有重要作用，mTOR 可以反馈性调节胰岛素敏感性，保护胰岛β 细胞［13］。吕相川等［14］报道，mTOR在2型糖尿病大鼠肝脏和肌肉的表达水平较正常大鼠明显升高，认为其可能参与了2 型糖尿病的发病。INOKI 等［15］发现，糖尿病肾病小鼠足细胞中mTORC1 的激活是诱导糖尿病肾病的关键。INOKI 的另一项研究则提出，TSC/mTOR 信号在调节细胞生长和生存控制中起关键作用，TSC/mTOR通路失调可能导致代谢紊乱，如糖尿病及其并发症［16］。本研究结果显示，与正常对照组相比，模型对照组视网膜组织中mTOR 表达水平明显升高；
与模型对照组相比，阳性对照组及雷帕霉素组mTOR 表达水平明显下降；
与阳性对照组相比，雷帕霉素组mTOR 表达水平明显降低。雷帕霉素能够结合哺乳动物mTOR，并通过抑制mTOR 的活化而进行细胞生长和代谢的调节。陈珏等［17］观察雷帕霉素对糖尿病肾病大鼠足细胞的作用，发现雷帕霉素可减轻糖尿病肾病大鼠的蛋白尿症状。肖堂利等［18］研究雷帕霉素对糖尿病肾病小鼠肾小球足细胞自噬和损伤的影响，以及对糖尿病肾病的改善作用，发现雷帕霉素可以减轻肾小球病理改变和足细胞损伤。结合本研究结果，雷帕霉素抑制mTOR 表达后，PI3K 和AKT表达也出现了一定的变化，推测抑制mTOR 可能成为DR 的潜在治疗方式。通过观察视网膜神经节细胞计数和视网膜病理变化，雷帕霉素组视网膜损伤较其他两组明显减轻，更加证实了这一推测，提示雷帕霉素能够对2型糖尿病大鼠的视网膜组织起到一定的保护作用。
综上所述，糖尿病大鼠给予雷帕霉素后，空腹血糖得到了一定的控制，视网膜神经节细胞及病理改变程度均得到不同程度的改善，其机制可能与雷帕霉素对PI3K/AKT/mTOR 信号通路的抑制有关。mTOR可能成为未来DR治疗的一个新的靶点。
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