miR-339-5p过表达对带状疱疹后遗神经痛大鼠疼痛缓解的机制
时间：2023-06-14 18:20:19 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
刘晋如 王平生 邱颐 王伟 王晓东
(1巴彦淖尔市医院疼痛科，内蒙古 巴彦淖尔 015000；
2内蒙古医科大学第二附属医院麻醉科；
3巴彦淖尔市医院麻醉科)
带状疱疹后遗神神经痛是皮肤科常见的皮肤性疾病之一，由水痘-带状疱疹病毒引起。该疾病会造成患者出现泛红，发热等症状，严重可能会造成肺炎和脑炎的发生，危及患者生命〔1〕。对于引起带状疱疹的病毒称之为为嗜神经性，病毒侵入感觉神经末梢后，可沿神经移动至脊髓后根神经节隐匿〔2〕。如果清除掉体内的病毒和感知周围神经，将不会出现后遗神经痛这一并发症的发生。带状疱疹后遗神经痛为带状疱疹较为常见的并发症，属于顽固性神经病理性疼痛疾病，主要症状多为自发痛、诱发痛、痛觉过敏等，此病病程大多迁延反复，临床治疗难度较大〔3〕。所以，对于带状疱疹后遗神经痛的发生，需要尽快干预，来缓解疾病情况〔4，5〕。本研究探究miR-339-5p过表达对带状疱疹后遗神经痛缓解机制。
1.1材料 研究动物：选取48只SPF级SD大鼠，雌雄各半〔单位名称：山东大学，许可证号：SYXK(鲁)2020 0022〕，月龄(4.75±0.95)个月，体重(268.38±35.62)g，温度22～25℃、相对湿度52%的清洁级环境中饲养1 w，光照12 h/d。环境安静，大鼠可自由饮水、饮食。
主要试剂：miR-339-5p(广州威佳科技有限公司)，白细胞介素(IL)-2、肿瘤坏死因子(TNF)-α及5-羟色胺(HT)相关的酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒均购自上海茁彩生物科技有限公司；
神经生长因子(NGF)ELISA试剂盒购自南京赛泓瑞生物科技有限公司，同源性磷酸张力蛋白诱导激酶(PINK)1抗体(武益普生物科技有限公司，货号：ATA35522)，帕金森蛋白(Parkin)抗体(武益普生物科技有限公司，ATA35114)，电子测通仪(上海玉研科学仪器有限公司，型号：2091)。
1.2分组及建模 48只大鼠随机分为空白组、过表达组、沉默组、模型组各12只，模型组、过表达组、沉默组。参照李晶晶等〔6〕研究实验带状疱疹后遗神经痛大鼠。构建方法：将CV-1细胞添加到杜尔贝克改良伊格尔培养基(DMEM)/F12中，并培养基制备细胞悬液，根据5.0×104/cm2接种于培养瓶，然后用VZV感染cV-1细胞，当CV-1细胞80%被感染，立刻收集并作细胞悬液接种带状疱疹病毒，将SD大鼠放入SPF实验环境为中等湿度、温度中，在造模前，用4%水合氯醛麻醉SD大鼠，在SD大鼠右脚底部皮下注射50 μl病毒接种溶液。感染7 d后如果大鼠出现机械痛敏阈值、热痛敏阈值降低，为造模成功。
1.3miR-339-5p基因表达量 收集入组所有大鼠的静脉血3 ml,对其静脉血进行离心处理，2 000 r/min，离心半径10 cm，离心8 min。miRNA采用miRVana PARIS试剂盒提取纯化。在室温下加入取出的500 μl血清样品等体积变性液,混合均匀，加入同样多的体积酸性酚氯仿,摇晃30～60 s；
室温下14 000 r/min离心5 min。把上清液放到另一个管中，加入1.25倍无水乙醇充分混匀，然后加入柱中，12 000 r/min离心30 s,弃滤液；
700 μl加入柱中，清洗1次,12 000 r/min离心30 s，弃滤液；
把500 μl加入柱中，清洗2次,12 000 r/min离心1 min；
95℃预热洗脱液60 μl加入柱子中，离心1 min 12 000 r/min,收集miRNA。miR-339-5p序列由miRBase数据库查得，miR-339-5p引物：5′-UCCCUGUCCUCCAGGAGCUCACA-3′。RNU6B上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游：5′-AACG CTTCACGAATTTG-3′。qRT-PCR提取DNA 0.5 ml血清加等量的裂解液于尖底离心管中，37℃孵育1 h,加入0.1 ml样品稀释液。PCR扩增取上述0.02 ml DNA提取液加入分装好的反应液管中。
1.4病理观察 采用猝死老鼠的方法，迅速分离出背部神经节组织，行病理切片，做常规脱蜡处理，苏木素-伊红(HE)染色，使用显微镜观察大鼠背部神经节组织病理变化情况。
1.5机械痛阈测定 使用电子测痛仪进行测定，测定时间为早晨8∶00～12∶00。将大鼠放在透明玻璃箱中，箱中底部有金属网，大鼠在玻璃箱中适应20 min，等大鼠平静后开始。各组实验大鼠刺激部位一样，用电子测痛仪刺激探头尖端轻轻垂直的刺激大鼠后脚足底，刺激强度逐渐增加，表示电子疼痛仪显示的强度值(单位：G)。如果大鼠出现舔足、缩足等,记录电子测痛仪显示的最大值(单位:g)。5 min/次,重复3次,机械缩足阈值(PMWT)是以3次健侧结果的平均值。
1.6IL-2、TNF-α、5-HT、NGF水平检测 采用ELISA检测大鼠IL-2、TNF-α、5-HT、NGF，采集所有大鼠血样本，静置1 h，3 000 r/min离心10 min,用移液枪吸取上清液，采用ELISA检测大鼠IL-2、TNF-α、5-HT、NGF，将IL-2、TNF-α、5-HT、NGF放入微孔中，依次放入标准样品、标本和辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体中，温育后清洗干净。底物是TMB，TMB在酸的作用下成黄色，过氧化物酶的催化下成蓝色。酶标仪测定在450 nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。
1.7Western印迹检测PINK1、Parkin蛋白表达 取相关脊髓组织，采用RIPA裂解液，从相关组织的匀浆内，提取蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白浓度进行测定。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，并将其浸泡于脱脂牛奶内，室温下密封4 h，加入稀释后的PINK1、Parkin兔单抗，孵育过夜(4℃)，加二抗，室温下孵育60 min。采用ECL定影，凝胶成像系统进行拍照。内参蛋白为β-actin，目标蛋白同内参蛋白的比值，作为蛋白的相对表达量。
1.8统计学方法 采用SPSS19.0软件进行F检验、t检验。
2.1病理观察 空白组无单核细胞浸润现象，神经节细胞形态结构正常；
模型组出现单核细胞浸润现象，神经节细胞变性；
过表达组存在较轻的单核细胞浸润现象，神经节细胞形态结构基本恢复正常；
沉默组出现大量单核细胞浸润现象，神经节细胞变性。见图1。
图1 各组背部神经节组织HE染色
2.2各组miR-339-5p基因表达量及不同时间点痛阈值比较 与空白组相比，模型组、过表达组、沉默组miR-339-5p表达均降低，模型组、过表达组、沉默组不同时间点痛阈值明显升高(P<0.05)。与模型组相比，过表达组miR-339-5p表达升高，不同时间点痛阈值降低；
沉默组miR-339-5p表达降低，不同时间点痛阈值升高，具有统计学差异(P<0.05)。与过表达组相比，沉默组不同时间点痛阈值升高，具有统计学差异(P<0.05)。见表1。
表1 各组miR-339-5p基因、不同时间点痛阈值比较
2.3各组SD大鼠血清IL-2、TNF-α、5-HT、NGF、PINK1、Parkin水平比较 与空白组相比,模型组、过表达组、沉默组IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明显升高,PINK1、Parkin表达明显降低(均P<0.05)。过表达组IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明显明显低于模型组,PINK1、Parkin明显高于模型组(均P<0.05)。与模型组相比,沉默组 IL-2、TNF-α、5-HT、NGF水平明显升高, PINK1、Parkin水平降低(均P<0.05)。与过表达组比较,沉默组IL-2、TNF-α 、5-HT、NGF水平明显升高,沉默组 PINK1、Parkin 表达明显降低(均P<0.05)。
见表2、图2。
表2 各组SD大鼠血清IL-2、TNF-α、疼痛5-HT、NGF、PINK1/Parkin信号通路基因水平比较
图2 Western印迹检测各组细胞PINK1/Parkin信号通路蛋白
带状疱疹后遗神经痛属于一种与脊髓、脊髓上中枢、外住神经敏化相关的神经疼痛，该疼痛呈现出阵发性电击样疼痛和针刺样持续烧灼痛〔7〕。疱疹治愈后，越有可能出现严重的神经疼痛，需要早期干预；
注意休息，认真吃药和擦药，服药期间不要吃辛辣食物:如海鲜、鸡蛋、鱼、牛羊肉及油炸食品，以清淡为主，多吃蔬菜和水果，补充维生素〔8,9〕。老年患者和虚弱病的患者应该避免严重并发症的发生:大多数老年患者由于身体功能下降,免疫功能低下,在带状疱疹的相关原因的作用,疾病容易发生严重并发症后,对虚弱的人来说,特别是长期使用糖皮质激素的患者一样,所以预防严重并发症的发生是非常重要的〔10,11〕。本研究说明miR-339-5p能够抑制5-HT、NGF释放，明显减少疼痛时间。
miRNA在神经系统中起到重要的作用，在机体内对脑内神经元的分化、神经元退行等过程进行参与，能够对机体神经元的正常运作产生作用。而miRNA的作用也与神经病毒的感染具有一定关联。如HSV-1、HIV等。在细胞凋亡、炎性的过程中，相关神经通过血液中的miRNA进行信号交换〔12〕。miR-339-5p在机体内对于神经元轴突形成突触这一过程进行参与，并且与神经祖细胞及神经母细胞瘤细胞相比，miR-339-5p自身的表达呈现下调状态，由此可得出，miR-339-5p可能对于神经元分化成熟过程进行了参与。miR-339-5p在不同神经病中的表达不同，miR-339-5p表达上调是由于乙醇诱导的大脑炎症导致的，乙醇可以刺激鼠小胶质细胞和大脑组织中miR-339-5p及炎性因子的表达。miR-339-5p在带状疱疹后遗神经痛表达下降，本研究结果表明miR-339-5p可能参与带状疱疹后遗神经痛的发展、发生。
5-HT存在于血清中，而在动物中存在于动物相关组织内，自身也是属于一种抑制性神经递质〔13,14〕。NGF是一种蛋白质，在动物中可以得出，能够对中枢神经元的生长情况进行调节，维持神经元的存活〔15〕。IL-2是一种趋化因子家族的细胞因子，它是一种由多细胞来源，具有多向性作用〔16〕。在机体的免疫应答和抗病毒感染中起着重要的作用，对T细胞的增殖能够产生刺激作用，使其活化T细胞自身活性增强。并且还能够对NK细胞的增殖产生刺激作用，并对LAK细胞产生诱导作用〔17,18〕。TNF-α是由活化单核细胞、T细胞、巨噬细胞、脂肪细胞、B细胞、成纤维细胞等多种细胞分泌的多向促炎细胞因子〔19〕。本研究说明5-HT、NGF和带状疱疹疼痛调制相关性较好，有致痛和镇痛双重作用。
PINKI以蛋白酶形态存在，属于高保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，自身的存在是由581个氨基酸组成，广泛在哺乳动物各组织器官中表达,在心脏、骨骼肌、神经系统中含量最高。Parkin是具有465个氨基酸的E3泛素连接酶，根据其氨基酸序列功能，可分为RINGO结构域、RING1结构域、N端泛素样结构域、RING2结构域、RING1与RING2之间的IBR结构域5个区域〔20〕。N端泛素样结构域的功能主要包括结合蛋白酶体、识别细胞基质、结合SH3、Parkin活性、调节泛素蛋白等。有研究表明PINK1/Parkin信号通路是调节线粒体自噬的主要途径之一。炎症、创伤等其他疾病引起神经损伤后,会导致神经细胞的氧化应激反应,从而导致功能出现损伤和神经病理性疼痛的发生。靳晓飞等〔21〕研究认为在缺血性脑卒中的发生发展过程中PINK1/Parkin信号通路介导的线粒体自噬起到重要的作用，可能为预防和治疗缺血性脑卒中找到新的治疗靶点和机制。本研究说明PINK1/Parkin信号通路在应激性疾病发病机制中起到重要作用，通过过表达PINK1、Parkin达到减少疼痛的效果，在应激状态下PINK1/Parkin信号通路受到抑制,PINK1/Parkin水平明显上升。
综上，过表达miR-339-5p基因经作用于PINK1/Parkin信号通路后，有效缓解疼痛程度，miR-339-5p可以成为对带状疱疹后遗神经痛诊断和病情判断的分子标志物。
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