牡丹籽油对去睾丸小鼠骨骼的影响
时间：2023-06-14 18:15:30 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
陈彩玲 郑晓艳 王可欣 刘翠娟 田佳 钟燕婷 林瑞 吴铁 许碧莲 崔燎，3
(1广东医科大学药学院药理学教研室，广东 湛江 524023；
2广东医科大学·广东润和生物科技有限公司辅酶Q10联合研究中心；
3广东天然药物研究与开发重点实验室)
根据世界卫生组织定义，骨质疏松(OP)是以单位骨量减少及骨组织显微结构破坏为特征，并导致骨生物力学性能下降，骨脆性增加、发生骨折及相关并发症的风险增加的一种全身性骨骼疾病〔1〕。随着年龄的增长，中老年男性的睾酮水平逐渐降低，发生睾酮缺乏〔2,3〕。传统观点认为老年男性OP主要与增龄性退化有关，近年来研究发现男性与女性相似，性激素水平在调节骨质量和骨代谢中起重要作用，睾酮缺乏是老年男性OP常见的继发因素之一，睾丸激素水平与骨折风险呈负相关〔4〕。男性性腺功能低下，雄激素不敏感综合征和接受雄激素剥夺疗法的前列腺癌与骨质流失和骨折风险增加密切相关〔5〕。临床研究表明对雄激素缺乏的男性OP患者补充雄激素有缓解作用〔6〕，随着各种雄激素补充剂的出现，如睾丸甾类，睾酮酯，烷基化睾酮，新雄激素制剂的普遍运用〔7〕，副作用也越来越明显，包括前列腺增生和前列腺癌〔8〕。为减少不良反应，人们相继研究开发选择性雄激素受体调节剂,如SARM，NEP28〔9〕，GTx-024〔10〕。
牡丹籽油(PSO)是从牡丹种子中提取的一种新型植物油，含有丰富的不饱和脂肪酸(n-3 PUFAs)：硬脂酸、棕榈酸、亚油酸、油酸和α硬亚麻酸，以α麻亚麻酸为主〔11〕，具有较高营养价值和保健功效，依据国家《食品安全性毒理学评价程序和方法》分析和探讨PSO的毒理学作用，PSO无急性毒性、遗传毒性和亚急性毒性，具有较高的食用安全性，作为功能性食品之一〔12〕。研究表明，PSO能可以降血糖〔13〕、降血脂〔14〕，其中含有的多不饱和脂肪酸具有潜在的抗炎和抗氧化活性〔15〕，对自由基和体内抗氧化能力具有较强的清除作用，可保护多种生物因素引起的氧化损伤〔16〕，还可对抗小鼠的衰老模型〔17〕，目前PSO对去睾丸小鼠骨组织的影响尚未见研究。本研究探讨PSO对去睾丸小鼠骨骼的影响。
1.1实验动物 40只SPF级4周龄雄性KM小鼠，体重(26±1)g，购自广东省医学实验动物中心，许可证号为SCXK(粤)2018-0002。
1.2药物与试剂 TU购于浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号：H10970240。PSO购于广东省广州市番禺南利油脂制品有限公司，批号：LS/T3242。生理盐水，购于广西裕源药业有限公司，批号：H19042908。
1.3仪器 PTY-224-423 电子天平( 福州华志科学仪器有限公司)；
858 Mini Bionix型材料测试系统(美国MST公司) ；
Viva Micro CT 40(SCANCO Medical AG) 。
1.4实验动物分组与给药 4周龄小鼠适应性饲养2 w后，按体质量随机区组法，随机分为假手术(Sham)组、去睾丸(ORX)组、TU组、PSO组，每组10只。Sham组进行假手术，其余组均进行双侧睾丸摘除手术。术后第2天开始灌胃给药，Sham和ORX组给予溶剂对照，TU组给予TU 10.4 mg/kg，PSO组给予牡丹籽油0.1 ml/10 g，给药1次/d，连续给药8 w。
1.5观察指标及测定方法
1.5.1体重的检测 实验开始后，每周称量小鼠体重1次，直至实验结束。取材前称体重作为最后的体重。第1次体重和最后的体重差值为体重增长值(△W)。
1.5.2骨生物力学的检测 实验结束后，取左侧股骨，去除股骨周围的肌肉和肌腱，采用Lloyd LR5K Plus 骨生物力学检测系统检测和分析标本的生物力学指标，实验采用三点弯曲法，步骤如下：将小鼠左侧股骨置于试验机上，用1 mm直径的压头，加载速度为2 mm/min，跨距为20 mm，股骨加压至发生骨折，这可提供屈服点和骨折参数的测量，仪器将及时记录出每个时刻点的载荷和桡度变化值，绘制出载荷-位移曲线，然后读取最大载荷、断裂载荷、弹性载荷，并计算刚性系数。
1.5.3Micro-CT的检测 将小鼠左侧股骨除尽肌肉和附着组织，放入微型计算机断层扫描技术(Micro-CT)仪，对股骨干骺端进行X射线扫描。viva CT40选择扫描参数:图像矩阵为2 048×2 048，整合时间为200 ms，能量/强度为70 kVp，114 μA，8 W。以0°旋转进行扫描。扫描完成后，选取距生长板远端1.0 mm、层厚2.0 mm的骨组织为松质骨感兴趣区域(ROI)行三维重建，以最低阈值为150提取图像信息。定量分析使用SCANCO Medical AG软件，分析参数。参数如下：连接密度(ConnD)、结构模型指数(SMI)、体积骨密度(BMD)、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分离度(Tb.Sp)。
1.5.4血清指标检测 实验结束时，小鼠眼球取血于1.5 ml EP管中4℃静置4 h，3 000 r/min离心10 min取上层血清。按照相应试剂盒说明书，测血清指标：超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素(IL)-6、超敏C反应蛋白(hs-CRP)。
1.6统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析、LSD-t检验。
2.1各组不同时间点体重及△W 与Sham组比较，ORX组ΔW下降但无统计学意义；
与ORX组比较，TU组和POS组ΔW明显上升(P<0.05，P<0.01)。见表1。
表1 各组不同时间点体重及ΔW比较
2.2各组骨生物力学性能的变化 与Sham组相比，ORX组弹性载荷明显降低(P<0.05)；
与ORX组相比，TU组刚性系数明显升高(P<0.01)，PSO组最大载荷、弹性载荷和刚性系数均明显升高(P<0.05，P<0.01)。见表2。
2.3各组股骨骨微结构的变化 与Sham组相比，ORX组Micro-CT参数中Conn.D.、BV/TV、Tb.N均明显下降(P<0.01)，而SMI和Tb.Sp明显增大(P<0.05，P<0.01)；
与ORX组比较，TU组Conn.D.、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显增大，而SMI、Tb.Sp均明显下降(P<0.05，P<0.01)；
PSO组Conn.D.、BV/TV、Tb.N和Tb.Th均明显增大，SMI、Tb.Sp均明显下降(P<0.05，P<0.01)。见表2。
2.4各组血清生化指标检测 与Sham组相比，ORX组IL-6、hs-CRP含量明显升高(P<0.05，P<0.01)；
与ORX组比较，TU组hs-CRP含量明显降低(P<0.05)；
与ORX组比较，POS组血清SOD含量明显增加(P<0.01)，MDA、IL-6、Hs-CRP含量有下降趋势但无统计学差异(P>0.05)。见表2。
表2 各组股骨远端骨微结构及血清生化指标比较
在临床上，雄激素剥夺疗法是治疗前列腺癌的有效方法，但研究发现其与骨质流失和骨折风险增加有关〔18〕，也常常采用唑来膦酸〔19〕、双膦酸盐〔20〕等药物预防雄激素阻断引起的骨丢失。在众多动物模型中寻找合适的雄激素缺乏引起的OP模型，发现睾丸切除术引起的原发性腺功能减退是诱导动物睾丸激素缺乏的首选方法，且符合临床雄激素剥夺疗法，并且有研究表明去睾丸模型大鼠出现骨矿物质密度和含量降低，骨骼的微结构损伤〔21〕。临床研究数据显示，TU对雄激素水平下降引起的老年男性OP的骨量及骨代谢有影响〔22〕，所以本研究采用TU作为阳性药物对照。PSO是一种天然植物油脂，成为我国的新资源食用油品种之一，其具有良好的抗氧化作用〔23〕，且具有较高的食用安全性〔12〕。在OP方面尚未见报道。
本研究ORX组骨量明显比Sham组少，给予TU后，骨量增多。这是因为睾酮由男性的睾丸或女性的卵巢分泌，具有维持肌肉强度及质量、维持骨质密度及强度、提升体能等作用，老年男性适当补充睾酮有利于维持骨质量和骨强度〔22〕。随着研究的深入，对骨微结构的观察已成为判断骨质量的常用指标〔24〕。SMI反映骨小梁板状和杆状的程度，板状骨小梁和杆状骨小梁的SMI依次为0和3。出现OP时，骨小梁从板状转变为杆状，SMI值增加。在服用睾酮或者PSO的小鼠，骨小梁丢失减少，阻止去睾丸后骨骼的骨小梁网络之间连接数量的减少，骨体积分数增加，这说明这两个药物可以减少这种骨的丢失，但还是远远不能达到对照组的水平。PSO与睾酮的作用一样，可以骨小梁数量和骨小梁厚度明显增加，并降低了骨小梁分离度，明显对抗去睾丸导致的骨量丢失的作用，但与对照组比较，这种拮抗作用，还是不能达到对照组的水平。延长给药周期会是否会更好的效果，这有待进一步的研究。
骨量增加并不一定表示骨的性能提高，需要进一步进行骨生物力学评价。骨生物力学特性测试以实现模拟真实受力情况并对骨骼进行力学特性评估。断裂载荷是指骨质在发生骨折前的塑性应变量，反映骨材料的可塑性，最大载荷反映了骨所能承受的最大外力，弹性载荷反映了骨在弹性范围所能承受的最大变形长度，刚性系数反映了骨标本外在的硬度，PSO明显增加了骨的最大载荷、弹性载荷和刚性系数这三种力学性能，说明了PSO具有明显的强骨功能，其中，应用PSO治疗的小鼠骨的弹性载荷比应用睾酮治疗的小鼠更强，骨组织抗变形能力上升，提示了PSO可以替代睾酮用于预防由于雄激素减少导致的骨力学性能下降。
激素的缺乏易引起机体出现相关衰老疾病，特别是氧化应激方面〔25〕。本研究结果显示，SOD对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基保护细胞免受损伤，MDA引发脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物。SOD活力的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA的高低又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。结果表明PSO对机体具有抗氧化作用〔17〕。另外，血清中相关炎症因子IL-6、hs-CRP含量下降，进一步说明PSO可能通过抗氧化对OP起到抑制作用。
本实验研究结果表明，PSO能改善去睾丸雄性小鼠的骨微观结构破坏，并增强骨生物力学性能。由相关炎症因子检测结果表明，PSO可以对抗机体的氧化作用。OP是常见的老年性疾病，由OP引起的老年性骨折越来越多，而且其术后恢复较差。在日常生活中，OP时常不伴随相关疼痛症状而且治疗OP的药物价格相对昂贵，并未引起人们的关注。PSO因具有较高的食用安全性，目前已经成为公认的功能性食品之一，其对于骨组织的影响尚未见报道，本实验研究成果为PSO在OP药物进一步的开发以及运用方面提供了理论依据。
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