两个遗传性异常纤维蛋白原血症家系分析
时间：2023-06-13 16:20:12 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
姜俊宇 金先富 苏正仙 蔡昀达 陈超超 应潇颖 毕晓洁
遗传性异常纤维蛋白原血症（congenital dysfibrinogenemia,CD）是一种罕见的常染色体显性或共显性遗传性疾病，发病率约为1/100万，临床表现多样[1-2]。Undas等[3]发现，有约20%的CD患者有血栓形成倾向，25%患者有不同程度的出血表现，其余患者无明显症状，仅表现为凝血功能异常。CD患者的出血表型通常为轻型，一般出血轻微且无严重后果，但当患者为育龄妇女或发生严重外伤等情况时应引起注意，应采取监测并及时干预以避免发生出血不止的情况[4]。某些Fib变体明显增加了血栓形成的风险，从而导致年轻的CD致病基因携带者有很强的阳性家族史和血栓形成事件的发生[5]。由于CD极为罕见且症状多变，临床上易发生误诊和漏诊。本研究对两个CD家系的突变基因进行扩增并测序，分析分子遗传学特征和临床表现的关系，预测并鉴定基因突变对Fib结构和功能的影响，初步探讨该病的分子发病机制，以期提高临床医生对CD的认知和诊疗水平，为CD患者的预防和治疗提供更好的帮助。
1.1 患者家系资料 家系1：患者男，52岁，浙江台州人，突发言语障碍，不能表达，经温州医科大学附属台州医院凝血功能检查示纤维蛋白原活性（fibrinogen activity,Fa）为0.63 g/L，TT为26.6 s；
头颅CT检查示“左侧额叶低密度影”，头颅CT血管成像检查示“左侧大脑中动脉局部管腔中重度狭窄”，诊断考虑为脑梗死、凝血功能异常。该患者肝肾功能正常，血脂指标正常，无明显出、凝血表现；
其姐姐存在相同的实验室检测结果异常，其他家系成员检测均正常。家系2：患者女，2岁，浙江台州人，经温州医科大学附属台州医院健康体检凝血功能常规检查示Fa为0.61 g/L，TT为34.6 s；
生化指标提示肝肾功能正常，Hb指标正常，无明显出、凝血症状，否认使用抗凝和降Fib药物。其父亲和祖父存在相同的实验室检测结果异常，其他家系成员检测均正常。两个家系的家系图见图1。
图1 遗传性异常纤维蛋白原血症家系图（a：家系1；
b：家系2）
1.2 健康对照组资料 收集200名健康成人和30名健康儿童体检者凝血常规检查结果作为正常对照，其中成年男性87名、成年女性113名，中位年龄36（20，59）岁；
男性儿童14名、女性儿童16名，中位年龄2（1，4）岁。230名受试者均无血栓或出血史，无肝肾功能疾病，所有试验血样均在受试者知情同意后采集。
1.3 标本处理 采集两个家系成员足量外周静脉血，按1∶9体积比加入到0.109 mmol/L枸橼酸钠抗凝管中，即刻充分混匀，3 000 r/min离心10 min。取上层抗凝血浆用于凝血功能常规指标检测，2 h内检测完毕；
取下层全血细胞提取DNA，置于-40℃冰箱保存备用。
1.4 凝血指标检测 采用凝固法测定所有标本的PT、APTT、TT，采用免疫比浊法测定D-二聚体（D-dimer,D-D）、纤维蛋白（原）降解产物（fibrinogen and fibrin degradation products,FDPs）水平，采用Clauss法测定Fa水平（法国STAGO STA-R MAX全自动血凝仪），所有检测步骤均严格遵守试剂（法国STAGO）说明书进行；
采用PT演算法测定所有标本Fib（抗原）水平（日本Sysmex公司CS-5100全自动血凝仪），所有检测步骤均严格遵守试剂（德国Siemens）说明书进行。
1.5 全血DNA提取与序列扩增 按照DNA提取试剂盒（上海西塘公司）提取先证者及其家系全血DNA，使用核酸定量分析仪检测提取的DNA含量和纯度。根据参考文献[6]设计PCR反应步骤：反应总体积为25.0 μl，其中 PCR MaserMix 12.5 μl，双蒸水7.5 μl，上、下游引物各1.0 μl，DNA模板3.0 μl。反应条件：94 ℃预变性5 min；
94 ℃ 30 s，56～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min；
30个循环后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后送往华大基因公司测序。采用Chromas软件将测序结果与美国GenBank所公布的Fib 3个基因FGA、FGB和FGG序列进行比对，寻找送检标本的基因突变位点，发现突变后进行反向测序确认。
1.6 生物信息学与蛋白空间构型分析 采用Polymorphism Phenotyping v2（蛋白质ID:P02679）和 Mutation Taster（蛋白质转录本ID:ENST00000404648）生物信息学在线预测突变对Fib蛋白结构和功能的影响；
采用PyMOL软件对Fib进行空间模型构建，分析突变前后Fib蛋白空间结构、氢键数量发生的改变。
2.1 先证者及其家系成员凝血功能检测结果 家系1先证者及其姐姐Fa显著下降，Fib正常，PT、TT均略高于正常范围，APTT、D-D、FDPs均在正常范围内；
家系2先证者及其父亲、祖父Fa显著下降，Fib稍低于正常值或正常，PT、APTT、TT均略高于正常范围，D-D、FDPs均在正常范围内。其他家系成员的凝血功能实验室结果均为正常。具体凝血功能测定结果见表1和表2。
表1 家系1先证者及家系成员凝血功能检测结果
表2 家系2先证者及家系成员凝血功能检测结果
2.2 基因检测结果 家系1先证者及其姐姐FGG基因第8外显子952位发生G＞A（c.952G＞A）杂合突变，导致292位甘氨酸突变为色氨酸（Gly292Ser）。家系2先证者及其父亲和祖父FGG基因第8外显子902位发生G＞A（c.902G＞A）杂合突变，导致275位精氨酸突变为组氨酸（Arg275His）。测序结果见图2（插页）。
图2 两个家系突变和正常FGG基因测序图（a：家系1先证者及姐姐FGG基因存在c.952G＞A杂合突变，箭头示突变位点；
b：家系1正常基因序列；
c：家系2先证者及父亲和祖父FGG基因存在c.902G＞A杂合突变，箭头示突变位点；
d：家系2正常基因序列）
2.3 生物信息学与蛋白空间构型分析结果 生物信息学预测后发现，两个家系中发生突变的Polymorphism Phenotyping v2积分均显示 1.00，“PROBABLY DAMAGING”、MutationTaster积分均为0.999 9，预测结果为“disease causing”；
两种软件均提示Gly292Ser和Arg275His为致病突变。空间构型分析发现，家系1中292位甘氨酸突变为色氨酸；
色氨酸与周围氨基酸形成的氢键数量较突变前增加，蛋白结构的空间稳定性发生改变。家系2中275位精氨酸突变为组氨酸，与周围氨基酸的氢键数量减少，影响所形成的Fib稳定性。两个家系Fib蛋白空间构型见图3（插页）。
图3 两个家系正常和突变Fig蛋白空间构型对比图（a：正常Fig蛋白空间构型，γ肽链292位Gly与周边氨基酸及水分子共形成1个氢键结构；
b：家系1突变蛋白空间构型，γ肽链292位Gly突变为Ser，氢键形成个数为4个；
c：正常Fig蛋白空间构型，γ肽链275位Arg与周边氨基酸及水分子共形成9个氢键结构；
d：家系2突变蛋白空间构型，γ肽链275位Arg突变为His，氢键形成个数为4个）
Fib是人体血浆中含量最高的凝血因子，由肝细胞粗面内质网合成并分泌，分子质量约为340 kDa。Fib是由3个独立基因FGA、FGB、FGG分别编码的3对肽链Aα、Bβ和γ通过二硫键连接而成的二聚体糖蛋白分子[7-8]。共同凝血途径中，Fib由凝血酶裂解成可溶性纤维蛋白单体后，在活化凝血十三因子（FⅩⅢa）和钙离子作用下形成不溶性纤维蛋白单体（fibrin monomer,FM）聚合物，参与人体止血过程[9-10]。CD是指Fib的3个编码基因中任何一个或者多个基因发生突变导致人体所合成Fib分子含量和（或）活性异常的一种遗传性疾病，突变最常发生于FGG基因，其次是FGA和FGB基因[11-12]，本研究中两个家系的突变位点均位于FGG基因，可见FGG是该病基因突变的好发区。
目前国内外尚无统一的CD诊断标准[13]。周伟杰等[14]认为大多数CD患者无明显症状，少数可出现轻度出血和（或）血栓形成；
凝血功能检查提示Fa明显下降，Fib正常或稍低，Fa/Fib＜0.70，生化指标提示肝肾功能正常，Hb正常；
对CD患者家系调查可知，绝大多数CD患者为常染色体显性遗传[15-16]，具有相同突变的患者及家系成员均存在类似的凝血功能异常检测结果；
对于可疑的CD患者，研究患者基因突变与出、凝血表现的相关性，需要进行Fib的基因突变检测。
本研究中，家系1先证者因突发言语障碍入院，实验室检查表现为Fa显著降低；
头颅影像学检查提示脑梗死，患者平时体健，既往无明显出血或血栓症状。对该先证者家系基因测序后发现其FGG基因存在Gly292Ser错义突变，Downes等[17]在1名血栓性疾病患者上发现该突变，国内还未有此突变的相关报道。Clinvar数据库收录该变异位点为临床意义未明[Variation ID：627185]，不同生物信息学软件分析预测均提示Gly292Ser具有致病性。Fib蛋白模型分析发现，Gly292Ser引起292位甘氨酸与周边氨基酸的氢键个数增多，使蛋白结构的稳定性发生改变。综合以上分析，在没有任何明确病因引起该先证者脑梗死的情况下，其突发疾病可能与Gly292Ser存在一定程度的关联，具体机制有待后续进一步研究证实。家系2先证者为健康体检的2岁女童，仅表现为不明原因Fa显著降低，其父亲在后续调查中检测出相同的Fa结果。基因测序结果发现，家系2先证者FGG基因c.902G＞A改变，导致精氨酸被组氨酸替换，即Arg275His；
而研究认为该突变是一个突变热点[18-20]，生物信息学软件分析预测均提示Arg275His错义突变具有致病性。同时进行的Fib蛋白模型分析也证实Arg275His引起275位组氨酸与周边氨基酸的氢键数量减少，蛋白结构的稳定性下降。与野生型（γ275Arg）相比，Arg275His导致Fib纤维分支增加，影响凝血酶催化纤维蛋白聚合过程中D-D的相互作用，从而破坏共同凝血途径中纤维蛋白束和纤维蛋白凝块的形成[21]。多数患者FGG基因Arg275His杂合突变可无任何症状，少数可出现出血或血栓等症状[6，22]。
CD临床表现差异巨大，不同突变位点、不同患者均可出现不同的临床表现。本研究中两个家系先证者均存在FGG基因突变，但是临床表现不尽相同。家系1先证者及其姐姐均存在FGG基因c.952G＞A改变，先证者在无任何诱因下突发脑梗死，治疗好转数月后，再次发生轻度言语障碍入院，头颅影像学提示脑部出现新发血栓，此突变在国内尚属首次发现，在国外也鲜有相关文章对该位点突变展开研究分析，因此具体临床意义尚未明了。鉴于先证者反复发生脑梗死，医生建议其长期规范抗凝治疗，同时密切关注抗凝引起的出血风险，必要时补充Fib。值得注意的是，先证者姐姐并没有类似临床症状，考虑到该家系存在一定血栓风险，医生做出清淡饮食、定期体检的临床建议。家系2先证者及其父亲均存在FGG基因c.902G＞A改变，但均无出、凝血病史，医生建议不做特殊治疗处理，优先采取临床观察措施，并叮嘱先证者及其家属提高安全意识，避免发生较大面积创伤等。
综上所述，CD目前尚无临床治疗指南，突变位点多样且表现因人而异，因此，在CD的临床治疗中，应完善患者Fib的基因分析，更好地评估其表型，根据其个人史、家族史、基因型等选择最佳临床治疗方案，给予患者个体化的治疗手段[23]。
猜你喜欢 证者氢键家系 江南油杉半同胞家系生长及遗传特性评价广西林业科学(2022年6期)2023-01-16Ⅰ型肢根型点状软骨发育不良家系的遗传学分析中华实用诊断与治疗杂志(2022年1期)2022-08-31发育性癫痫性脑病75型家系的遗传学分析中华实用诊断与治疗杂志(2022年1期)2022-08-31新生儿异常Hb Q的家系分析*临床输血与检验(2022年3期)2022-06-22盐酸四环素中可交换氢和氢键的核磁共振波谱研究波谱学杂志(2021年3期)2021-09-071例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者的家系表型及基因突变分析山东医药(2021年24期)2021-09-01——以高中化学“氢键”的教学为例">正确把握课标要求 精准实施有效教学*——以高中化学“氢键”的教学为例教学月刊（中学版）(2020年13期)2020-12-296 个遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症家系的表型与基因型诊断诊断学(理论与实践)(2020年1期)2020-04-28研究人员实现生物质中氢键裁剪与重构杭州化工(2020年2期)2020-01-16一个两次多囊肾胎儿孕育史家系的临床分析及遗传咨询郑州大学学报（医学版）(2019年3期)2019-06-03
