安卡拉病毒贵州分离株Fiber2基因的克隆及序列分析
时间：2023-06-11 11:35:14 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
方 天， 何 玲， 尹德晶， 岳 筠， 朱二鹏，3， 文 明，3， 程振涛,3
(1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；
2.贵州省动物疫病预防控制中心，贵州贵阳550008；
3.贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州贵阳550025)
安卡拉病是由安卡拉病毒感染引起的一种禽类高发病，最早发现于巴基斯坦卡拉奇周围区域。该病毒又称禽腺病毒血清4型(Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4)，鸡感染后的特征性病变为心包积液-肝炎综合征(Hydropericardium hepatitis syndrome，HHS)[1]。2013年国内FAdV-4的感染病例开始增多，2015年疫情迅速蔓延，在中国吉林、江苏、山东等东部地区均有发生[2-3]。贵州省于2016年首次报道此病[4]，随后多地呈现局部流行。3～5周龄的肉鸡最为易感，发病后死亡率为30%～70%，感染鸡的日龄越大则死亡率越低[5]。安卡拉病可通过水平传播和垂直传播2种方式感染健康鸡[6]，FAdV-4能在粪便、鼻气管黏膜和肾脏中存活较长时间，其在粪便中载毒量最高，表明FAdV-4水平传播的主要途径为粪-口传播，其次为短距离的飞沫传播，垂直传播则是通过种蛋、鸡胚等途径传播。FAdV-4也可与该属其他血清型病毒混合感染导致禽类发病[7]；
FAdV-4与具有免疫抑制特性的病毒(如传染性法氏囊病病毒)混合感染禽类时，引起的死亡率会进一步升高[8]。
FAdV-4为双股线状的DNA病毒，无囊膜，其结构蛋白质主要包括Penton五邻体蛋白、Hexon六邻体蛋白以及Fiber1纤突蛋白、Fiber2纤突蛋白。Hexon蛋白构成病毒粒子的面，Penton蛋白构成顶，Fiber1和Fiber2纤突蛋白则位于病毒粒子表面[9]。据报道，Fiber2蛋白具有良好的免疫原性，在介导FAdV-4感染宿主细胞中发挥重要作用，可以诱导机体产生中和抗体，有效刺激机体产生体液免疫[10]。本研究拟通过对FAdV-4贵州株(GZ-QL)Fiber2基因进行克隆与生物信息学分析，了解FAdV-4贵州株Fiber2基因的遗传变异情况，明确Fiber2蛋白相关生物学特点，为深入解析该蛋白的功能及新型疫苗研制提供一定的科学参考。
1.1 主要毒株
GZ-QL和DH-5α菌株均由贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室保存。
1.2 主要试剂
酵母粉、胰蛋白胨购自英国OXOID公司；
2×TaqPCR MasterMix、2 000 bp DNA marker、5 000 bp DNA marker、pMD19-T载体、DNA限制性内切酶Hind Ⅲ、XbaI均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；
DNA基因组小量提取试剂盒、E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit胶回收试剂盒、E.Z.N.A.TM Plasmid Kit质粒提取试剂盒购自Omega Bio-Tek公司。
1.3 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2基因扩增
1.3.1 引物设计与合成 根据NCBI基因库中已公布的FAdV-4经典株ON1的基因序列(登录号：GU188428)，利用引物设计软件Primer Premier 5.0设计包含Fiber2全基因序列的特异性引物。Fiber2-F：5′-TCCTATCCCTTTTTCCTATCAG-3′；
Fiber2-R：5′-GTTTTTAGAAAGCGTAAATCTGTTG-3′，预扩增片段的大小为1 425 bp。
1.3.2 基因组DNA的提取 将病毒培养物分装到1.5 ml EP管中，8 000 r/min离心30 s取上清液，使用DNA基因组小量提取试剂盒提取病毒DNA，将提取的病毒DNA作为PCR扩增的模板。
1.3.3 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2基因的PCR扩增 通过普通PCR方法扩增FAdV-4Fiber2基因，构建25 μl反应体系，短暂离心后旋涡振荡混匀，按照以下反应条件进行PCR扩增：94 ℃预变性3 min；
94 ℃变性45 s，61 ℃退火40 s，72 ℃延伸80 s，35个循环；
72 ℃延伸10 min。取出PCR扩增产物后，转入含Goldview I核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，随后于凝胶成像系统中进行拍照分析。
1.4 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因克隆与测序
使用胶回收试剂盒对琼脂糖凝胶内的目的基因进行回收纯化。将目的基因连接至pMD19-T载体后转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞，涂布LB固体平板后置于37 ℃静置培养12 h，挑取单菌落接种LB液体培养基，放入37 ℃恒温摇床中继续培养12 h。使用质粒提取试剂盒提取质粒，通过PCR方法，使用pMD19 T载体通用引物筛选阳性重组质粒；
进一步使用限制性内切酶XbaⅠ和Hind Ⅲ 对重组质粒pMD19 T-Fiber2进行双酶切鉴定；
把质粒PCR和双酶切鉴定结果均为阳性的重组质粒送至华大基因科技有限公司进行DNA测序。
1.5 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因序列分析
对测序后的基因片段进行拼接，在NCBI下载禽腺病毒属各血清型Fiber2基因序列，使用软件DNAStar将GZ-QLFiber2基因序列与选取的各血清型参考毒株Fiber2基因进行同源性比对和系统进化树分析；
进一步推导出GZ-QL株Fiber2蛋白的氨基酸序列，并将此序列与ON1弱毒株、MX-SHP95弱毒株、四川SCnj1601强毒株、北京NIVD2强毒株Fiber2蛋白的氨基酸序列进行比对分析。各血清型FAdV毒株Fiber基因参考序列信息见表1。
表1 FAdV Fiber基因参考序列
1.6 FAdV-4 GZ-QL 株 Fiber2蛋白生物信息学分析
应用在线软件ExPASy-Protparam对GZ-QL株Fiber2蛋白进行理化性质及氨基酸组成分析。应用在线软件ProtScale对GZ-QL Fiber2蛋白进行疏水性与亲水性分析。应用在线软件SOPMA、Swiss-model预测GZ-QL Fiber2蛋白的二级结构和三级结构。分别应用在线软件TMHMM Server v.2.0和SingalP v3.0对GZ-QL Fiber2蛋白进行跨膜区域和信号肽分析。应用在线软件Protean和IEDB的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0抗原表位预测工具对GZ-QL Fiber2蛋白进行B细胞抗原表位预测和分析。
2.1 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2基因扩增
以FAdV-4 GZ-QL株的DNA样本为模板，以Fiber2-F/Fiber2-R为特异性引物进行PCR扩增，扩增片段进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。结果显示，扩增出的特异性基因片段大小约为1 425 bp，与目的片段的预期大小一致(图1)。结果初步表明成功扩增出了FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因。
M：5 000 bp Marker；
1～2：扩增产物。图1 FAdV-4 Fiber2基因PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of FAdV-4 Fiber2 gene
2.2 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因重组质粒的鉴定
采用质粒PCR方法和双酶切鉴定重组质粒pMD19 T-Fiber2。由图2可知，重组质粒PCR均能扩增出大小约1 425 bp的目的条带，而空白对照组无此条带；
由图3可知，重组质粒经XbaⅠ和HindⅢ双酶切后，均能产生与预期大小(1 425 bp)一致的目的基因条带以及对应的克隆载体片段(2 692 bp)，而空载体经过相同的双酶切后只产生与预期大小(2 692 bp)一致的载体片段。结果表明，GZ-QLFiber2基因成功插入到pMD19-T克隆载体中。
M：2 000 bp marker；
1～3：重组质粒；
4：空白对照。图2 FAdV-4 Fiber2基因重组质粒鉴定结果Fig.2 PCR identification results of restructuring plasmid of FAdV-4 Fiber2 gene
M：5 000 bp marker；
1～3：重组质粒；
4：pMD19-T。图3 FAdV-4 Fiber2基因重组质粒双酶切鉴定结果Fig.3 Identification results of FAdV-4 Fiber2 gene recombinant plasmid digested by double enzymes
2.3 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因同源性和系统进化树分析
将FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因序列和参考株ON1、SCnj1601、NIVD2等毒株Fiber2基因序列进行同源性和系统进化树分析。由图4可知，FAdV-4 GZ-QL株与四川分离的SCnj1601强毒株、北京分离的NIVD2强毒株Fiber2基因核苷酸同源性均为100.0%；
和ON1 经典株Fiber2基因的核苷酸同源性为95.9%；
与基因型一致的FAdV-10CX-1毒株同源性为96.2%；
与剩余血清型(FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-5、FAdV-6、FAdV-7、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-11)的同源性相对较低，约为45.9%～52.2%。由图5可知，FAdV-4 GZ-QL株与四川SCnj1601强毒株、北京NIVD2强毒株位于相同进化分支；
与国外ON1经典株、MX-SHP95弱毒株及血清10型的CX-1相比存在多点位氨基酸突变，同属于一个大的进化分支，均为FAdV-C(基因型)；
与国内外其他血清型处于不同分支，亲缘性较远。提示，FAdV-4Fiber2基因在本血清型内相对保守，与其他血清型之间差异较大。
图4 核苷酸序列同源性比对分析结果Fig.4 Analysis results of nucleotide homology
图5 系统进化树分析结果Fig.5 Analysis results of phylogenetic tree
2.4 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2蛋白生物信息学分析
2.4.1 FAdV-4Fiber2基因推导的氨基酸序列分析 把基因测序得到的序列片段进行拼接，获得FAdV-4 GZ-QL株Fiber2全基因序列，使用软件DNAstar推导氨基酸序列，并将此序列与ON1弱毒株、MX-SHP95弱毒株、四川SCnj1601强毒株、北京NIVD2强毒株氨基酸序列进行比对分析。由图6可知，FAdV-4 GZ-QL株Fiber2基因编码479个氨基酸，与四川SCnj1601强毒株、北京NIVD2强毒株Fiber2蛋白氨基酸序列完全一致；
但与国外FAdV-4 ON1弱毒株、MX-SHP95弱毒株相比，分别有33处、27处氨基酸突变，且在第11～15位氨基酸处均存在5个氨基酸插入。
图6 推导的氨基酸序列Fig.6 Amino acid sequences derived
2.4.2 FAdV-4 GZ-QL株Fiber2蛋白理化性质分析 应用在线软件ExPASy-Protparam分析预测GZ-QL株Fiber2蛋白的理化性质及氨基酸组成。结果显示，QZ-QLFiber2基因编码序列(CDS)区大小为1 440 bp，对应编码479个氨基酸，推测蛋白质相对分子质量为50 000，其蛋白质理论等电点为4.376，共有43个氨基酸带负电荷，其中29个天冬氨酸(Asp)、14个谷氨酸(Glu)，23个氨基酸带正电荷，其中11个精氨酸(Arg)、12个赖氨酸(Lys)，脂肪系数为89.31，溶于水中的不稳定指数为33.47(若指数超过40.00，则代表不稳定)，提示该蛋白质较稳定。该蛋白质氨基酸组成中，共含有3类碱性氨基酸，其中精氨酸11个、组氨酸(His)3个、赖氨酸12个，总计26个，占比为5.4%(26/479)；
含有2类酸性氨基酸，其中天冬氨酸29个、谷氨酸14个，总计43个，占比为9.0%(43/479)；
进而推测Fiber2蛋白可能为酸性蛋白质。该蛋白质共含有7类亲水性氨基酸，总计200个，占总氨基酸的41.8%(200/479)；
共含有8类疏水性氨基酸，总计210个，占总氨基酸的43.8%(210/479)；
蛋白质亲水性平均值为-0.031(负值代表亲水，正值代表疏水)，提示该蛋白质可能为亲水性蛋白质。同时应用ProtScale在线软件预测Fiber2蛋白氨基酸序列的亲/疏水性。如图7所示，纵坐标分值高于0的部分为疏水区，低于0则为亲水区，分值绝对值越高，对应的亲/疏水性则越强；
在Fiber2蛋白的氨基酸中，位于270位的氨基酸得分最高(2.02)，疏水性最强；
位于第10位的氨基酸得分最低(-3.13)，亲水性最强。预测结果显示，FAdV-4 GZ-QL株Fiber2蛋白亲水区域多于疏水区域，表明Fiber2蛋白为亲水性蛋白质，具备成为优势抗原的潜力。
2.4.3 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2蛋白二级结构、三级结构预测 应用SOPMA软件预测GZ-QL Fiber2蛋白二级结构，由图8可知，Fiber2蛋白α-螺旋占总体的4.8%，β-转角占总体的8.1%，延伸链占总体的35.3%，无规则卷曲占总体的51.8%。整个二级结构组成以无规卷曲为主，易于形成抗原表位。同时，通过Swiss-model软件对其三级结构进行预测，由图9可知，该蛋白质三级结构中无规则卷曲和延伸链占比均相对较高，这与该蛋白质二级结构预测结果一致。
图7 FAdV-4 Fiber2蛋白的疏水性分析结果Fig.7 Hydrophobicity analysis result of FAdV-4 Fiber2 protein
h表示α-螺旋；
t表示β-转角；
c表示无规则卷曲；
e表示延伸链；
右侧数字表示氨基酸在肽段中的位置。图8 FAdV-4 Fiber2 蛋白二级结构预测Fig.8 Prediction of secondary structure of FAdV-4 Fiber2 protein
2.4.4 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2蛋白跨膜结构和信号肽分析 分别应用在线软件TMHMM Server v.2.0和SingalP v3.0分析预测GZ-QL株Fiber2蛋白的跨膜区域和信号肽。由图10可知，该蛋白质无跨膜结构域；
由图11可知，该蛋白质无信号肽，推测其为非分泌蛋白质。
图10 FAdV-4 Fiber2蛋白跨膜结构域预测Fig.10 Prediction of transmembrane domains of FAdV-4 Fiber2 protein
2.4.5 FAdV-4 GZ-QL 株Fiber2蛋白B细胞抗原表位预测 应用Protean抗原表位预测工具对GZ-QL Fiber2蛋白进行B细胞抗原表位预测和分析，主要分析其亲水性、柔韧性、抗原表位及氨基酸表面可及性。由图12可知，Fiber2蛋白具有丰富的B细胞表位，且软件分析结果显示，N端2～38区域拥有最高的抗原指数、柔韧性、亲水性和表面可及性，很可能是病毒粒子识别细胞膜表面受体并与之结合的区域。进一步使用IEDB的Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0软件预测蛋白质抗原表位，结果如图13所示，除了较短氨基酸序列之外，GZ-QL Fiber2蛋白共含有8个分值较高的区域，可能是该蛋白质的优势抗原表位区域。
图11 FAdV-4 Fiber2蛋白信号肽预测Fig.11 Signal peptide prediction of FAdV-4 Fiber2 protein
图12 Protean预测Fiber2蛋白B细胞表位参数结果Fig.12 Results of Fiber2 protein B cell epitope parameter predicted by Protean
图13 IEDB预测Fiber2蛋白B细胞表位参数结果Fig.13 Results of Fiber2 protein B cell epitope parameter predicted by IEDB
腺病毒是一种在自然界中分布广泛、理化性质相对稳定且具有较强传染性的病原体[11-12]，国际病毒委员会于2021年将腺病毒科划分成6属87种[13]。其中，禽腺病毒属病毒是禽类主要的传染病病原之一，且主要在鸡群中传播。该属相关的病毒种类非常多，不同亚群腺病毒的致病特点也存在一定的差异性。根据群特异性抗原特征将禽腺病毒分为Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群，根据系统进化树、基因组分为A～E 5个基因型[14]。本研究中的FAdV-4为Ⅰ群禽腺病毒血清4型，基因型为C型。从目前流行状况来看，FAdV-4的致病性呈现上升趋势[15-16]。流行病学调查结果显示，国内流行的FAdV-4分离株(HN、AQ、AH726、JS07和AH712)Fiber2基因与国外早期流行毒株(JSJ13)相比，已经发生了较大变异[17]，血清型相同的毒株之间，其致病性也存在很大差异[18]。推测FAdV-4在传播过程中发生了变异，导致毒力发生了变化，致病性增强。本研究发现，GZ-QL株 Fiber2蛋白氨基酸序列与国内其他地区流行毒株一致；
但与国外早期流行的弱毒株(ON1、MX-SHP95)相比，GZ-QL株 Fiber2蛋白在11～15位存在5个氨基酸插入，而软件分析结果显示该区域拥有最高的抗原性、柔韧性、亲水性和表面可及性，可能是病毒粒子与细胞膜上受体结合的位点，对于病毒复制过程至关重要。那么，GZ-QL株毒性的增强是否与这5个氨基酸插入突变有关？本研究结果为这一推测提供了依据，但仍需要进一步验证。已有研究结果表明，Fiber2蛋白和Hexon蛋白与FAdV-4的致病性有密切关系[19]，在病毒内化过程中，Fiber2蛋白能够直接与宿主细胞膜上受体结合，从而影响病毒的致病性[20]，而Fiber1蛋白和Penton蛋白对病毒的毒力无直接影响[21]。如果能证实GZ-QL株Fiber2蛋白N端这5个氨基酸插入突变在病毒吸附和致病过程中的作用，将会为阐释FAdV-4的致病机制提供更多证据。
Fiber2蛋白为FAdV-4的结构蛋白，其抗原表位具有型特异性和亚属特异性，可有效诱导B细胞产生抗体[22]。生物信息学软件分析结果表明，FAdV-4贵州株Fiber2蛋白具有良好的抗原性，并且与国内其他地区分离株高度同源，但与Ⅰ群其他血清型毒株核苷酸序列同源性较低，提示Fiber2蛋白在本血清型内相对保守，具有作为基因工程疫苗靶标蛋白质的潜力。
研究发现，将鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因与FAdV-4的Fiber2基因融合后进行原核表达，得到的重组蛋白质能与FAdV-4阳性血清发生特异性反应，且在动物试验中产生了良好的免疫保护效果[23]。郭浩然等[24]制备的抗Fiber2蛋白多克隆抗体和王萍等[25]制备的抗FAdV-4 Fiber2单克隆抗体与Fiber2蛋白及病毒阳性血清样品结合均能产生特异性反应，证实Fiber2蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。基因序列的生物信息学分析有助于了解编码蛋白质的结构与成分，可为目的蛋白质的体外表达和后续开发利用等奠定基础。本研究通过生物信息学分析，预测了FAdV-4 Fiber2蛋白的理化性质和抗原表位，结果表明，Fiber2蛋白可作为免疫抗原的候选蛋白质，研究结果为开展FAdV-4新型疫苗研制奠定了基础。
FAdV-4贵州分离株Fiber2基因总长度是1 440 bp，共编码479个氨基酸，与中国SCnj1601以及NIVD2株的氨基酸序列相同；
与国外MX-SHP95、ON1经典株相比，存在多位点的氨基酸突变，属于同种的不同进化分支。Fiber2蛋白属于亲水性蛋白质，无跨膜区和信号肽，相对保守且抗原性良好，具备成为优势抗原的潜力。
