楚雄华山松种子园无性系SRAP,多样性分析*
时间：2023-06-07 21:00:09 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
赵文植，鲁 华，辛 静，马路遥，王正德，沈伟祥，王 飞，辛培尧
(1.西南林业大学，国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心，云南 昆明 650224；
2.西南林业大学，西南地区生物多样性保育国家林业和草原局重点实验室，云南 昆明 650224；
3.云南轿子山国家级自然保护区管护局，云南 禄劝 651515)
华山松(Pinus armandiiFranch.)为松科(Pinaceae)松属(Pinus)常绿乔木[1]，是中国特有的造林树种，也是重要的园林造景植物。在云南华山松是仅次于云南松的针叶造林树种，在生态林建设和林产业发展中起着极其重要的作用。然而，长期引种单一类型的华山松种源进行纯林营建，导致其生长量持续减缓、生长势明显衰退，继而引发多种病虫害以及木材品质变劣[2]。为了挖掘更新的优良遗传资源，充分利用潜在的遗传变异，提高林分生产力，自1970 年起，中国便开始了华山松的种质改良工作，并获得了较大成就，为华山松的良种选育提供了一定的理论基础和实践指导[3]。由于种种原因，目前云南省华山松林的资源状况、经营技术和产业水平与其地位极不相称，存在如种质资源退化、良种选育滞后、利用水平低下和产品附加产出低等问题。因此，要实现华山松种植的产业化、优质化和高效化，需从根本上解决其良种选育、繁育及高效栽培问题，其中，明确现有种质资源的遗传基础研究是良种选育的核心问题。
随着分子生物学及其相关技术的快速发展，分子标记被广泛用于澳洲坚果(Macadamia integrifolia)[4]、东北杏(Prunus mandshurica)[5]、紫薇(Lagerstroemia indica)[6]和山核桃(Carya cathayensis)[7]等木本植物的遗传改良。在众多分子标记中，相关序列多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)标记由于操作简单、稳定性好、结果重复率高且在基因组中均匀分布等特点，已在多种木本植物如云南松(P.yunnanensis)[8]、黑松(P.thunbergii)[9]、红松(P.koraiensis)[10]、马尾松(P.massoniana)[11]、刺梨(Rosa roxburghii Tratt)[12]、桤木(Alnus cremastogyne)[13]、花椒(Zanthoxylum bungeanum)[14]和土沉香(Aquilaria sinensis)[15]等的遗传多样性研究中有所报道。叶鹏等[16]对华山松SRAP 遗传多样性引物进行筛选，并成功获得15 个引物组合；
在此基础上，刘成等[17]以楚雄市华山松种子园内的60 个无性系样本为材料，对其SRAP 遗传多样性进行了分析，为SRAP 标记应用于华山松的遗传改良奠定了良好的基础。然而，由于引物组合数量以及遗传材料样本量不足，其研究结果存在一定的局限性，不能对该种子园内的华山松无性系群体进行全面且准确的评价，所获得的遗传信息较为有限，从而影响其在华山松遗传改良工作中的应用。基于上述原因，本研究利用更多的SRAP 分子标记引物，对该种子园内来自6 个种源的所有96 份华山松无性系进行深入的遗传分化及遗传多样性研究，全面了解该种子园内华山松无性系的群体遗传结构，以期为在该种子园内进行华山松良种选育提供理论基础及实践指导。
1.1 材料来源
试验材料采自云南省楚雄市华山松无性系种子园，分别来自会泽、腾冲、南华、巍山、宜良和楚雄6 个种源地，样本数量共计96 份，均为无病虫害单株的新鲜幼嫩针叶(表1)。所采针叶分别按单株装入自封袋并编号，保存于-80 ℃冰箱，备用。
表1 华山松6 个自然群体的地理位置信息及样本数Tab.1 Geographical information and number of samples of six natural populations of Pinus armandii
1.2 PCR 扩增反应
1.2.1 引物来源
引物组合序列 (表2) 一部分来自已报道的华山松SRAP 引物组合11 对[17]；
另一部分则通过对已报道的思茅松[18]、番木瓜[19]和棉花[20]等植物相关文献中的引物序列进行组合，然后再进行引物对筛选。SRAP 引物组合由上海生物工程有限公司合成。
表2 SRAP 标记的引物信息Tab.2 Forward and reverse primer information of SRAP markers
1.2.2 引物筛选
以上、下游各13 个引物随机组合获得169对引物组合。采用改良CTAB 法对所有华山松样本基因组DNA 进行提取[21]，然后随机选取8 份不同华山松无性系样本DNA 作为模板进行PCR扩增；
在1%琼脂糖凝胶中对合成的SRAP 引物组合进行初筛，再利用初筛得到引物和已有SRAP引物组合对8 份华山松样本DNA 进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳复筛。
1.2.3 PCR 扩增反应及程序
采用经优化的华山松SRAP 分子标记PCR 扩增反应体系及程序[17]进行SRAP-PCR 扩增试验。
1.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
采用周延清等[22]的方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳试验，并依据电泳结果图统计多态性条带，有条带的记录为“1”，无条带的记录为“0”，最终制成供统计软件分析的(0,1)矩阵。
1.4 数据分析
(1) 采用POPGEN 1.32 计算群体多态位点百分率(P)、Shannon 多样性指数(I)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)和基因流(Nm)等。
(2) 采用POPGEN 1.32 计算华山松群体遗传距离和遗传相似性系数；
按照UPGMA 法进行聚类图的构建和分析，并对华山松群体的遗传距离和相对地理距离进行Mantal 检测。
(3)采用Structure 2.3.1[23]分析华山松的群体遗传结构，估计最佳群体组群数(K值)。设置K值为1～10 之间，重复运行5 次，ΔK最大时对应的K值为研究物种的最优群体数。
(4) 采用GenAlEX 6.41[24]对华山松种源间的遗传变异水平进行AMOVA 分析。
2.1 SRAP 引物组合的初筛与复筛
通过对169 对引物组合的初筛，最终新筛选得到15 对条带清晰、明亮且具有较高多态性的华山松SRAP 引物组合(表3 和图1)。利用初筛得到的15 对和已有的11 对SRAP 引物组合(共计26 对)对8 份不同无性系华山松样本DNA 进行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳复筛发现：26 对SRAP引物组合均可获得清晰、明亮且具有较高多态性的条带(图2)，可用于96 份华山松无性系DNA样本的遗传多样性分析。
图1 部分引物初筛结果Fig.1 Partial results of primer screening
图2 部分 (ME13-EM3) 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.2 Partial (ME13-EM3) results of polyacrylamide gel electrophoresis
表3 新筛15 对多态性SRAP 引物序列信息Tab.3 SRAP sequence information of the 15 polymorphic primer for P.armandii
2.2 华山松SRAP 位点遗传多样性分析
由表4 可知：基于26 对SRAP 引物组合，6个种源共扩增出52 个等位基因，平均每对引物组合2 个等位基因；
有效等位基因数最高的是ME2-EM9 (1.818 2)，最低的是ME3-EM5 (1.259 2)，平均值为1.511 6；
Shannon 多样性指数(I)最高的是ME2-EM9 (0.635 9)，最低的是ME3-EM5 (0.310 7)，平均值为0.467 4；
Nei’s 遗传多样性指数(H)最高的是ME2-EM9 (0.445 1)，最低的是ME3-EM5(0.180 4)，平均值为0.306 2。比较H值和I值可知：H值低于I值，且二者值的变化关系呈正相关关系。说明筛选到的26 对SRAP 引物组合在6 个华山松种源中有较好的多态性，可用于6 个华山松种源的遗传多样性分析。
表4 华山松26 个引物多样性信息Tab.4 The 26 primers diversity informations of P.armandii
2.3 华山松6 个种源间遗传多样性
由表5 可知：华山松6 个种源平均等位基因数(Na)为1.672 3，变化范围在1.408 7～1.969 0 之间；
平均有效等位基因数(Ne)为1.436 0，变化范围在1.385 7～1.503 8 之间；
Shannon 多样性指数(I)变化范围在0.350 1～0.459 7，平均值为0.394 4；
Nei’s 遗传多样性指数(H)最大值为巍山(0.301 2)，最小值为宜良(0.231 7)，平均值为0.259 5；
多态位点百分率平均值为81.22%。上述结果说明：6 个种源的Na平均值和Ne平均值差异较小，等位基因较少，I值和H值均处于较低水平，种源间遗传变异较小，遗传多样性水平较低。
表5 不同种源的华山松遗传多样性信息Tab.5 The genetic diversity information of different P.armandii provenances
2.4 华山松群体遗传分析
由图3 可知：96 份华山松无性系样品的ΔK值在K值为2 时最大，即华山松无性系样品可划分为2 个最优群体。第1 个组群包含29 个无性系，为会泽和巍山种源；
第2 个组群包含67 个无性系，为腾冲、宜良、楚雄、巍山及南华种源。Structure 结果(图4)分析发现：以Q值为界限，Q≥0.6 的无性系有58 个，占60.41%；
Q值＜0.6 的无性系有38 个，占39.58%；
Q=0.6 时，华山松大部分样本被划为同一色区，但有少部分样本被划为不同色区，说明华山松6 个种源间存在一定的基因交流。以上结果表明6 个种源的96 份无性系材料的遗传背景比较单一。
图3 lnP(D)和ΔK 随K 值的变化趋势Fig.3 Trend of lnP(D) and ΔK with K value
图4 样品材料群组遗传结构Fig.4 Group genetic structure of sample material
2.5 华山松不同种源间的遗传距离和遗传一致度
由表6 可知：不同种源的华山松遗传相似系数介于0.914 0～0.973 1 之间，平均遗传相似系数为0.943 1；
遗传距离变化范围在0.027 3～0.090 0之间，平均值为0.058 7。会泽种源和巍山种源之间有着最大的遗传相似系数和最小的遗传距离，表明会泽种源和巍山种源的亲缘关系最近，遗传差异较小；
而宜良种源和腾冲种源之间有着最小的遗传相似系数和最大的遗传距离，表明宜良种源和腾冲种源的亲缘关系最远，遗传差异较大。总体来看，6 个华山松种源间遗传相似性系数较高(＞0.90)，遗传距离较小(＜0.09)，表明6 个华山松种源间亲缘关系比较相近，遗传背景单一，遗传变异丰富度低。
表6 华山松种源间Nei’s 遗传相似系数和遗传距离Tab.6 Nei’s genetic identity and genetic distance of P.armandii provenances
2.6 群体间遗传关系聚类分析
种源间UPGMA 聚类结果(图5)显示：当遗传相似系数为0.944 0 时，可将6 个种源聚为3组：第1 组包括会泽、巍山和腾冲种源；
第2 组包括楚雄和南华种源；
第3 组仅有宜良种源。
图5 华山松6 个种源聚类分析Fig.5 Cluster analysis of six provenances of P.armandii
2.7 华山松各种源地理距离相关性检验
Mantel 检测结果(图6)显示：各散点较为散乱，未呈现出一定规律性，且P值为0.202，说明遗传距离与地理距离在华山松不同种源间无显著相关性，地理距离对其遗传距离的影响不明显。
图6 Mantel 检测遗传距离和地理距离的相关性Fig.6 Correlation of genetic distance and geographical distance by Mantel detection
2.8 华山松种源间遗传分化
AMOVA 分析结果(表7)显示：华山松不同种源的遗传差异主要位于种源内，高达93.26%；
种源间的遗传分化相对较小，仅为6.74%。这表明种子园不同种源无性系的遗传变异主要来源于种源内。
表7 6 个种源的AMOVA 分析Tab.7 Analysis of molecular variance for six provenances
由表8 可知：华山松种源总基因多样性在0.173 4～0.431 1 之间，平均值为0.300 3；
种源内基因多样性在0.158 4～0.400 9，平均值为0.265 2；
种源间基因多样性在0.010 4～0.089 0 之间，平均值为0.035 1；
种源遗传分化系数变化范围在0.048 4～0.214 0 之间，平均值为0.116 9，表明总的遗传变异中有11.69%来自种源间，有88.31%的遗传变异来自种源内，遗传变异主要存在于种源内；
此外，6 个种源间的基因流平均值为3.777 2，远大于1，表明各种源间遗传分化偏低。
表8 遗传分化系数和基因流Tab.8 Genetic differentiation index and gene flow
3.1 华山松遗传多样性
在遗传多样性分析中，通过对Nei’s 遗传多样性指数(H)、Shannon 多样性指数(I)和多态性位点(PPB)三者结合分析，能够准确、有效地反映种群的遗传多样性水平[25]。本研究表明：楚雄华山松种子园内不同种源间的遗传多样性水平较低，这与刘成等[17]对该群体内60 个无性系单株针叶进行SRAP 遗传多样性分析的结果一致。赵杨等[26]利用ISSR 标记对贵州省平坝华山松无性系种子园遗传多样性进行研究，指出华山松无性系种子园遗传多样性处于较高水平，且遗传变异主要存在于种源内。在马尾松[27]、红松[28]、油松[29]和油茶[30]等种子园无性系中也有类似的研究结果。
3.2 华山松遗传分化
遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm)是反映群体间遗传分化和衡量群体内近交程度的重要指标[31]。楚雄华山松种子园无性系群体间的Gst平均值为0.116 9，种源内的遗传多样性占总群体的占88.31%，遗传变异主要存在于种源内；
Nm值为3.777 2＞1，表明6 个华山松种源间存在较大的基因流动，使得华山松无性系种源间遗传背景一致，变异程度降低。对黑松[9]、红松[10]、刺梨[12]、桤木[13]、花椒[14]和土沉香[15]等的研究也表明：遗传变异主要来自于种源内的个体间，而各种源间存在一定的基因互渗现象。对杉木地理种源的遗传多样性分析指出：杉木各种源间存在的较强基因流并不完全是由各种源间自然产生的，而是2 000 多年广泛且大规模无序栽培引起不同地理种源在不同地点相遇，尤其是距离较远的种源之间的相遇，也就是人为因素导致不同种源间的遗传交流，最终使同一地理种源内的遗传多样性程度变高，且不同种源间遗传变异快速缩小[32]。因此，长期人为的造林单位间无序大规模种子的调拨、混合以及飞播造林等均会导致华山松种源间遗传多样性程度降低，并提高种源内的遗传多样性；
此外，杂食性鸟类、兽类和啮齿类的取食行为促进了华山松种子传播，也在一定程度上增加了种源间的基因流动[33]。综上所述，在楚雄华山松种子园内进行杂交育种工作，应更多考虑从种源内选择亲本。
3.3 华山松群体遗传结构和亲缘关系分析
在生物分类学中，种源间的亲缘关系远近主要以遗传相似性和遗传距离为依据。遗传相似性与遗传距离具有一定的相关性，一般认为遗传距离越小、遗传相似度越高，亲缘关系越近[34-35]。本研究发现：华山松6 个种源的遗传相似系数高，遗传距离小，其亲缘关系较近，遗传基础较窄。巍山和会泽种源的遗传距离最小，遗传相似系数最大，亲缘关系较近；
而宜良和腾冲种源有着最远的亲缘关系，说明各种源间的亲缘关系远近与其地理分布并不存在显著相关性。对黑松[9,36]、棕榈[37]、流苏树[38]和桑树[39]等的研究也有类似结果。分析其原因可能是研究的空间尺度较小，种源间环境因子差异小，没有形成相对隔绝的地理隔离，种源间表现不出遗传差异[40]。因此，今后的林木育种实践应以DNA 水平的评价为主要依据，适当参考地理距离远近进行亲本选配，进而最大限度地发挥亲本杂交后代的杂种优势。
3.4 不同分子标记研究结果差异分析
不同分子标记技术的原理不同，在对物种进行遗传多样性分析时获得的结果存在一定的差异。辛静等[41]和徐剑等[42]也曾分别利用SSR 和SCoT 标记对该种子园内的相同无性系进行遗传多样性分析。综合比较，SRAP 标记覆盖的位点及所揭示的6 个种源间遗传相似系数平均值均高于SCoT 和SSR 标记，但Nei’s 遗传多样性指数(H)、Shannon 多样性指数(I)和多态性位点(PPB)等参数均低于SCoT 和SSR 分子标记；
此外，3 种标记均反映出遗传变异主要来自于种源内。可见，不同的分子标记揭示的遗传多样性水平和基因组位点数等存在一定差异，但这3 种分子标记之间并不相互排斥，结合3 种分子标记结果更有利于准确揭示种源间的亲缘关系和变异情况。
楚雄华山松种子园无性系的种源间遗传多样性程度较低，而种源内遗传差异较大；
6 个种源的地理距离与其遗传距离不存在明显的相关性。因此，以该种子园作为华山松遗传改良的平台，应充分考虑分子水平的评价结果，适当参考地理距离进行杂交亲本的选配等工作，并注重种源内无性系个体间的杂交。
