提取方法对叶绿素含量的影响
时间：2023-06-07 16:35:15 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
徐 伟，季索菲
(1.安徽林业职业技术学院，安徽 合肥 230031；
2.安徽省农业科学研究院，安徽 合肥 230061）
植物光合色素主要包括叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素等。其中高等绿色植物的叶绿素主要是叶绿素a、叶绿素b两种［1］，叶绿素a呈蓝绿色，叶绿素b呈黄绿色。叶绿素分子中含有很多共轭双键，能捕获光能，并将捕获的光能传递到反应中心色素，因此也常被称为天线色素。叶绿素分子含有一个卟啉环的“头部”和叶绿醇的“尾巴”，因此不溶于水，易溶于有机溶剂，所以一般用乙醇或丙酮等有机溶剂来提取。叶绿素含量是反映植物特别是光合机构生理状况的一个基本指标［2］，其含量的多少与光合能效的高低有着重要的关系。因此，植物生理学的研究常常离不开植物组织中叶绿素含量的测定。
叶绿素具有特定的紫外吸收光谱［3］，根据朗伯-比尔定律D=KCL，D为吸光度，C为溶液浓度，K为吸光系数，L为液层厚度，可用分光光度计精确测定叶绿素含量。常用的测定方法包括研磨法和浸提法两种。研磨法中使用最为广泛的是Arnon改良法：将待测植物材料称重、剪碎、研磨、冲洗、过滤、定容、测定吸光值、带入公式换算出叶绿素含量。浸提法：将待测植物材料剪碎置于有机溶剂中浸泡，待叶片叶绿素完全进入浸提液后，测定浸提液的吸光值，再带入公式换算出叶绿素含量。有报道指出：使用不同的方法，即使同样的样品、同样的鉴定仪器，测定的结果差别也可能在20%以上［4］。目前暂时没有绝对准确的测定方法。本试验用绿萝的叶片为试验材料，使用丙酮研磨法、96%乙醇和DMSO浸提法分别测定叶绿素含量，比较测定结果，分析相关原因，为今后植物叶片叶绿素含量测定提供参考。
1.1 植物材料
采取11月份安徽省合肥地区自然光下生长的绿萝顶部的第一片叶为试验材料。
1.2 研究方法
擦拭绿萝叶片表面并在自来水下冲洗干净，避开主叶脉，用边长1cm的模板或面积1cm2的打孔器截取单位面积叶片，然后剪成宽1-2mm、长5mm左右的细丝备用。
1.2.1 研磨法提取
将叶片细丝放入研钵中，加入少量石英砂、碳酸钙和2-3mL80%丙酮，研磨成匀浆。将匀浆沿玻璃棒倒入垫有滤纸的漏斗中进行过滤，用少量80%丙酮反复冲洗，直至研钵和滤纸上的色素全部冲洗干净，以避免因色素残留造成误差。最后用80%丙酮定容至10mL，放入棕色试剂瓶中待测定。
1.2.2 浸提法提取
将取样得到的叶片细丝分别浸入装有DMSO和96%乙醇的10mL容量离心管中，盖紧瓶盖，用锡纸包裹离心管营造黑暗环境，浸提至叶丝完全变白，约24h，期间轻轻晃动离心管，然后取出叶丝，分别用DMSO和96%乙醇定容至10mL待测定。
1.3 叶绿素含量计算
研磨法以80%丙酮溶液为空白对照，浸提法以DMSO和96%乙醇为空白对照，用元析UV-5100紫外分光光度计测量对应波长的吸光度。每种处理测定3次，取平均值计算。由于叶绿素在不同溶剂中的最大吸收峰的波长有差异，在80%丙酮溶液中的最大吸收峰的波长理论值分别是663nm和646nm，按照Lichtenthaler对Arnon法进行修正的公式计算叶绿素浓度［5］：
在96%乙醇中的最大吸收峰的波长分别为665nm和649nm，计算叶绿素浓度的公式［5］为：
用DMSO浸提法计算叶绿素的浓度时，测量波长665、649nm时的吸光度，参照Alan的计算公式［6］：
单位面积叶绿素含量=叶绿素浓度*提取液体积/叶片面积，D是吸光值，Ca是叶绿素a浓度，Cb是叶绿素b浓度。利用EXCEL2007和DPS数据软件对数据进行统计分析［7］。
2.1 叶绿素提取液的吸收光谱分析
将得到的叶绿素提取液倒入1cm的比色皿中，分别以80%丙酮、DMSO和96%乙醇为空白对照，用紫外分光光度计扫描500-750nm波段，每间隔1nm读取吸光值，根据测定结果，以波长为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制叶绿素吸收光谱曲线图。
图1 绿萝叶绿素提取液的吸收光谱
叶绿素在三种提取液的紫外吸收光谱图相似，有些许偏差。但是最大吸收值不同，表明不同的提取液对叶绿素的提取能力不同。叶绿素在80%丙酮溶液的最大吸收波峰在665nm，OD值为0.184±0.022，公式中需要测量663nm处的OD值为0.173±0.021，两处OD值相差6%，通过计算P值为0.544，差异不显著。叶绿素在DMSO溶液的最大吸收波峰在667nm，OD值为0.310±0.032，公式中需要测量665nm处的OD值为0.297±0.031，两处OD值相差4%，通过计算P值为0.645，差异不显著。叶绿素在96%乙醇溶液的最大吸收波峰在666nm，OD值为0.294±0.016，公式中需要测量665nm处的OD值为0.286±0.016，两处OD值相差3%，通过计算P值为0.568，差异不显著。因此可以使用以上公式对叶绿素含量进行计算。但是在646nm［8］处叶绿素b的吸收峰并未检测到，此结果与刘畅等［9］研究一致。
2.2 不同提取方法对叶绿素提取效果的影响
由表1可知，将三种方法得到的Ca和Cb进行比较，发现80%丙酮研磨法所得Ca和Cb均低于DMSO和96%乙醇浸提法。其中DMSO浸提法所得Ca和Cb均最高，分别是80%丙酮研磨法所得Ca和Cb的1.68和1.91倍。但96%乙醇浸提法得到的叶绿素浓度的标准差最小，一般来说标准差较小代表测量值较为集中，测量结果比较稳定。DMSO和96%乙醇浸提法得到的Ca差异不显著，但他们均与80%丙酮研磨法所得Ca差异极显著。DMSO浸提法所得Cb浓度最高，80%丙酮研磨法所得Cb浓度与DMSO浸提法所得Cb差异显著但达不到极显著水平。
表1 不同提取方法叶绿素含量
2.3 不同提取方法对叶绿素稳定效果的影响
将80%丙酮研磨法、DMSO和96%乙醇浸提法得到的提取液分别放置在自然光下曝光20分钟、40分钟、60分钟后测定叶绿素含量，结果见表2。80%丙酮研磨法所得的叶绿素在自然光下放置20分钟、40分钟、60分钟后基本没有变化。DMSO浸提法得到的Ca分别下降10.80%、9.14%、4.97%；
Cb分别下降21.52%、5.03%、13.99%，但各组间差异不显著。96%乙醇浸提法得到的Ca放置20分钟后与原Ca差异极显著，放置20分钟和放置40分钟后Ca差异不显著，放置40分钟后和放置60分钟后Ca差异极显著，且Ca下降高达68.60%。96%乙醇浸提法得到的Cb放置20、40分钟后Cb差异不显著，但放置40、60分钟后Cb差异极显著，Cb下降高达54.17%，由此可知：96%乙醇浸提法提取的叶绿素溶液尽量不要曝光20分钟以上，提取过程中要严格避光保存；
80%丙酮研磨法提取的叶绿素稳定性相对较好。
表2 不同提取方法对叶绿素稳定性的影响
在测定植物叶片的叶绿素含量时，不同叶龄或不同生长期的叶片、同一种植物不同位置的叶片之间都有明显差别，所以本试验为了减小误差，选用同一棵绿萝顶部的第一枚叶片为材料。大多数植物Ca/Cb的比值在3左右，本试验测得的Ca/Cb在2.8-3.5之间，符合大多数健康植物Ca/Cb比值规律，可信度较高。但研磨法所得叶绿素提取液的浓度低于DMSO和96%乙醇浸提法得到的叶绿素提取液浓度，可能是由于叶片研磨不充分，且冲洗、过滤等过程中叶绿素有所损失所导致。
本试验中叶绿素在三种提取液中的吸收光谱图虽然相似，但红光区的最大吸收峰位置均不相同，这可能是由于不同溶剂对叶绿素有增、减色效应。本试验中叶绿素在红光区的最大吸收波峰与经典公式中的最大吸收峰也相差1～2nm，这可能是由于紫外分光光度计的灵敏度有差异，邱念伟［10］就证明叶绿素在80%丙酮溶液和DMSO浸提液中的最大吸收峰不是一个固定值，而是一个区间；
也有可能是植物叶片中含有多种物质成分，提取液将这些物质均提取在溶液中，多种物质成分的吸光性叠加后造成最大吸收峰偏离。
常见的叶绿素含量表示方法有两种：一种是以叶片单位鲜重来表示，一种是以叶片单位面积来表示。本试验以叶片单位面积来表示叶绿素含量，这样测量的叶绿素含量可以不受叶片含水量变化的干扰。同时，由于光合作用速率也通常是以单位面积表示，可以更好地将叶绿素含量和光合速率联系起来进行对比分析［11］。
光合速率的变化在某些情况下可能是由于叶绿素含量的差异引起的，也可能是由于叶片气孔开合引起的，还有可能由于其他未知因素引起的［12］。光合速率的高低与叶绿素含量并不呈正相关。仅仅在弱光下，光合速率会随叶片叶绿素含量的增加而增高，而在饱和光下光合速率往往与叶绿素含量的多少无关［11］。合肥地区每年11月日照强度相对较弱，此时取材所测得的叶绿素含量多少是否能作为测定光合速率的依据还有待研究。
用80%丙酮研磨提取法、96%乙醇和DMSO浸提法都能提取植物叶片中的叶绿素。研磨法需要对叶片进行研磨和过滤等操作，这些过程会导致叶片中的叶绿素有所损失，以致叶绿素测量值偏低，且在野外不方便开展研磨法操作。浸提法操作简便，提高了野外实验的可操作性，浸提液DMSO虽有一定的刺激性，但与丙酮相比其毒性更低［13］，在一般情况下对人影响较小，且叶绿素提取液1小时内稳定性较好，因此可以作为良好的叶绿素提取溶剂；
浸提液96%乙醇，毒性小、价格便宜且是常见化学试剂也可以作为很好的叶绿素提取溶剂，但叶绿素提取液稳定性稍差，叶绿素提取过程应注意避光保存。
