抗氧化反应元件信号通路调控胆囊癌细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的机制研究
时间：2023-06-07 11:25:21 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
郭贻龙，陈宝，黎伟
作者单位：海口市人民医院，a急诊科，b药学部，海南 海口 570208
胆囊癌是临床常见的一种恶性肿瘤，由于胆囊癌病人早期临床症状不明显导致病人确诊时已处于中晚期从而失去最佳治疗时机［1-3］。血根碱主要分布于博落回与白屈菜的全草及血水草的地上部分，既往研究显示血根碱具有抗炎、抗肿瘤等多种生物学活性［4-5］。但血根碱对胆囊癌的作用及其机制尚未可知。Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）/核因子E2相关因子2（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路属于抗氧化应激通路，研究表明抑制Ke⁃ap1/Nrf2/ARE信号通路激活可促进肿瘤细胞凋亡［6］。但血根碱是否通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路影响胆囊癌细胞生物学行为尚未阐明。本研究于2018年1月至2019年9月观察了血根碱对胆囊癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响，并进一步分析了其对Keap1/Nrf2/ARE信号通路的调控作用。
1.1 材料人胆囊癌细胞GBC-SD购自美国ATCC细胞库；
胎牛血清、DMEM培养基购自美国Thermo Fisher公司；
血根碱购自南京道斯夫生物科技有限公司；
二甲基亚砜（DMSO）、噻唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；
丙二醛、活性氧、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；
Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Corning公司；
膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒购自美国BD公司；
蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；
二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、细胞裂解液购自北京全式金生物技术有限公司；
兔抗人增殖细胞核抗原（PCNA）、增殖标记蛋白细胞增殖核抗原-67（Ki-67）、活化胱天蛋白 酶-3（cleaved-caspase-3）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）一抗购自美国Santa Cruz公司；
兔抗人Keap1、Nrf2、血红素加氧酶1（HO-1）一抗购自美国Cell Signaling Technology公司；
山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 实验分组 取人胆囊癌细胞GBC-SD，接种至含10%胎牛血清体积分数和1%双抗体积分数的DMEM培养基内，置于37℃、5%二氧化碳体积分数的细胞培养箱内常规培养，待细胞生长至密度达90%时加入0.25%胰蛋白酶消化后进行传代培养。取对数期GBC-SD细胞，分别接种至含有2、4、8 μmol/L血根碱的培养基中常规培养48 h［7］，记为血根碱低浓度组、血根碱中浓度组、血根碱高浓度组，另取未进行任何处理的人胆囊癌细胞GBC-SD记为空白组。
1.2.2 MTT检测细胞增殖抑制率 收集各组长至对数期的人胆囊癌细胞GBC-SD，调整为3×104个/mL的细胞悬液，按100μL/孔接种于96孔板，每组3个复孔。加入20μL/孔的MTT溶液培养4 h，弃去上清，以DMSO（150μL/孔）孵育10 min，上多功能酶标仪测定各组人胆囊癌细胞GBC-SD吸光度值（OD 490 nm）。细胞增殖抑制率（%）=［（1-OD实验组/OD空白对照组）×100%］。
1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集各组长至对数期的人胆囊癌细胞GBC-SD，调整细胞浓度为1×104个/mL，加入预冷过的PBS洗涤，4℃条件下以1 000 r/min离心5 min，弃上清液，加500μL结合缓冲液重悬细胞，之后加入Annexin V-FITC和PI各5μL，充分混匀于暗室反应20 min，上流式细胞仪分析细胞凋亡率。
1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移与侵袭 收集各组长至对数期的人胆囊癌细胞GBC-SD，消化后加入无血清培养基并调整细胞密度为5×104个/mL，将细胞悬液以200μL/孔接种至Transwell小室的上室，另按照600μL/孔将含10%胎牛血清的培养基加入至Transwell小室的下室，置于37℃、5%二氧化碳体积分数的培养箱内孵育24 h，加多聚甲醛固定20 min后加入0.1%结晶紫染色10 min，于光学显微镜下观察并计数迁移细胞。侵袭实验中的Transwell小室上室需要预先铺设Matrigel基质胶，其余操作同迁移实验，光学显微镜下观察并计数侵袭细胞。
1.2.5 检测活性氧、丙二醛、GSH含量与SOD活性
应用荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平：不含血清培养基稀释DCFH-DA（20μmol/L），37℃恒温培养箱孵育30 min，利用多功能酶标仪与机关共聚焦显微镜检测细胞内活性氧水平，以空白组为对照计算实验组活性氧含量。收集各组对数期GBC-SD细胞，采用WST-1法检测SOD活力；
采用微量酶标法检测GSH含量；
采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛含量，以上各实验均根据试剂盒说明书进行操作。
1.2.6 蛋白质印迹法检测PCNA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、cleaved-caspase-3、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达 收集各组长至对数期的人胆囊癌细胞GBCSD，加裂解液裂解30 min，通过蛋白提取试剂盒提取蛋白。BCA法蛋白定量。将蛋白样品加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）上样缓冲液，高温煮沸10 min制成蛋白样液。以30μg/孔蛋白样液上样至凝胶，经电泳分离，转膜，封闭，加入PC⁃NA、Ki-67、MMP-2、MMP-9、cleaved-caspase-3、Ke⁃ap1、Nrf2、HO-1与β肌动蛋白（β-actin）一抗，4℃孵育24 h，次日加入相应二抗，37℃条件下孵育2 h，经TBST充分漂洗后曝光显影，应用ImageJ 1.41软件分析各条带灰度值，上述所有操作均重复实验3次。
1.3 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以±s表示，采用两独立样本t检验进行两组间比较，采用单因素方差分析进行多组间比较。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 不同浓度的血根碱对胆囊癌细胞增殖的抑制作用用不同浓度的血根碱处理GBC-SD细胞，结果显示，与空白组相比，血根碱低浓度组、血根碱中浓度组、血根碱高浓度组GBC-SD细胞抑制率显著升高（P<0.05），PCNA、Ki-67蛋白相对表达量显著降低（P<0.05），见图1，表1。
图1 蛋白质印迹法检测胆囊癌细胞PCNA和Ki-67蛋白表达
表1 血根碱抑制胆囊癌细胞存活及PCNA和Ki-67蛋白表达/±s
表1 血根碱抑制胆囊癌细胞存活及PCNA和Ki-67蛋白表达/±s
注：PCNA为增殖细胞核抗原，Ki-67为细胞增殖核抗原-67。①与空白组比较，P<0.05。
组别空白组血根碱低浓度组血根碱中浓度组血根碱高浓度组F值P值重复次数3333 PCNA蛋白1.18±0.09 0.83±0.07①0.67±0.07①0.45±0.05①166.75<0.001 Ki-67蛋白1.04±0.09 0.87±0.07①0.73±0.08①0.63±0.05①52.10<0.001细胞抑制率/%2.07±0.68 12.49±1.53①23.08±2.64①44.67±3.68①511.93<0.001
2.2 血根碱抑制胆囊癌细胞迁移和侵袭与空白组相比，血根碱低浓度组、血根碱中浓度组、血根碱高浓度组迁移、侵袭细胞数及MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量均显著降低（P<0.05），见表2，图2。
图2 蛋白质印迹法检测胆囊癌细胞MMP-2和MMP-9蛋白表达
表2 血根碱抑制胆囊癌细胞迁移和侵袭及MMP-2和MMP-9蛋白表达/±s
表2 血根碱抑制胆囊癌细胞迁移和侵袭及MMP-2和MMP-9蛋白表达/±s
注：MMP-2为基质金属蛋白酶-2，MMP-9为基质金属蛋白酶-9。①与空白组比较，P<0.05。
组别空白组血根碱低浓度组血根碱中浓度组血根碱高浓度组F值P值重复次数3 3 3 3 MMP-2 0.85±0.06 0.46±0.05①0.38±0.04①0.25±0.03①279.21<0.001 MMP-9 0.72±0.08 0.37±0.05①0.21±0.04①0.17±0.03①197.97<0.001细胞迁移数/个243.19±15.48 146.34±12.56①98.85±9.82①75.79±7.37①361.23<0.001细胞侵袭数/个136.68±8.37 97.43±7.15①46.65±5.34①38.15±4.53①449.77<0.001
2.3 血根碱诱导胆囊癌细胞凋亡与空白组相比，血根碱低浓度组、血根碱中浓度组、血根碱高浓度组细胞凋亡率及cleaved-caspase-3蛋白相对表达量显著升高（P<0.05），见图3，表3。
表3 血根碱诱导胆囊癌细胞凋亡和增加cleaved-caspase-3蛋白表达/±s
表3 血根碱诱导胆囊癌细胞凋亡和增加cleaved-caspase-3蛋白表达/±s
注：cleaved-caspase-3为活化胱天蛋白酶-3。①与空白组比较，P<0.05。
组别空白组血根碱低浓度组血根碱中浓度组血根碱高浓度组F值P值重复次数3 3 3 3 cleaved-caspase-3 0.15±0.02 0.29±0.03①0.35±0.04①0.41±0.05①82.67<0.001细胞凋亡率/%3.62±0.63 8.59±1.02①14.16±1.14①18.84±1.65①288.73<0.001
图3 流式细胞术检测各组胆囊癌细胞凋亡情况
2.4 血根碱对胆囊癌细胞氧化应激的影响实验结果显示，与空白组相比，血根碱低浓度组、血根碱中浓度组、血根碱高浓度组细胞活性氧、丙二醛水平显著升高（P<0.05），SOD活性与GSH含量显著降低（P<0.05），见表4。
表4 血根碱对胆囊癌细胞活性氧含量、SOD活性、GSH含量和丙二醛含量的影响/±s
表4 血根碱对胆囊癌细胞活性氧含量、SOD活性、GSH含量和丙二醛含量的影响/±s
注：SOD为超氧化物歧化酶，GSH为还原型谷胱甘肽。①与空白组比较，P<0.05。
组别空白组血根碱低浓度组血根碱中浓度组血根碱高浓度组F值P值重复次数3333活性氧（相对于空白组）1.04±0.08 1.34±0.06①1.85±0.09①2.23±0.13①287.90<0.001 SOD/（kU/g prot）76.17±4.64 61.84±5.7*①53.73±4.83①47.14±4.25①58.59<0.001 GSH/（μmol/g prot）34.66±2.14 21.94±2.86①17.38±2.05①12.55±1.83①161.11<0.001丙二醛/（μmol/g prot）4.59±0.71 13.48±1.17①23.79±1.73①34.16±2.25①593.31<0.001
2.5 血根碱诱导胆囊癌细胞Keap1/Nrf2/ARE信号通路的影响与空白组相比，血根碱低浓度组、血根碱中浓度组、血根碱高浓度组细胞中Keap1、Nrf2、HO-1蛋白相对表达量显著降低（P<0.05），见表5。
表5 血根碱对胆囊癌细胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达的影响/¯±s
表5 血根碱对胆囊癌细胞Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表达的影响/¯±s
注：Keap1为Kelch样ECH相关蛋白1，Nrf2为核因子E2相关因子2，HO-1为血红素加氧酶1。①与空白组比较，P<0.05。
组别空白组血根碱低浓度组血根碱中浓度组血根碱高浓度组F值P值重复次数3333 Keap1 0.89±0.08 0.67±0.09①0.56±0.06①0.34±0.05①91.63<0.001 Nrf2 0.68±0.05 0.49±0.06①0.38±0.06①0.35±0.04①71.04<0.001 HO-1 0.63±0.07 0.58±0.06①0.54±0.05①0.28±0.04①56.17<0.001
胆囊癌发展过程中涉及多种基因和信号通路的异常，相关研究表明有多种药物可通过调控胆囊癌细胞的增殖、凋亡等生物学行为进而实现治疗作用［8-9］。然而，中医药有效成分在治疗胆囊癌中的作用机制尚未阐明，因而本研究积极探究药物对胆囊癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响。血根碱可通过促进氧化应激反应的发生而诱导卵巢癌细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长［10］。研究表明血根碱在胰腺癌等多种肿瘤发生过程中发挥抗癌作用，并可抑制肿瘤发展进程［11］。与上述研究结果相似，本研究结果显示血根碱可明显抑制胆囊癌细胞增殖，并可抑制PCNA、Ki-67蛋白表达。研究表明PCNA、Ki-67属于细胞增殖标记物，其在肿瘤中呈高表达并可促进细胞增殖［12］。本研究结果提示血根碱可能通过抑制PCNA、Ki-67表达从而抑制胆囊癌细胞增殖。MMP-2、MMP-9是肿瘤转移相关基因并可促进肿瘤细胞迁移及侵袭［13］。本研究结果显示血根碱可显著抑制胆囊癌细胞的迁移和侵袭，并抑制MMP-2、MMP-9蛋白表达，这提示血根碱可能是通过下调MMP-2、MMP-9的表达实现减弱胆囊癌细胞迁移及侵袭能力的作用。caspase-3处于caspase级联反应的下游，并可作为凋亡执行者，当细胞接收凋亡信号时激活caspase-3促进cleaved-caspase-3的生成进而诱导细胞凋亡［14］。本研究结果显示血根碱处理胆囊癌细胞后，细胞凋亡率及cleaved-caspase-3表达量均明显显著升高，提示血根碱可能是通过上调cleaved-caspase-3的表达诱导胆囊癌细胞凋亡。
细胞氧化应激与细胞凋亡密切相关，本研究进一步检测氧化应激相关指标，结果显示血根碱处理后，胆囊癌细胞中活性氧、丙二醛水平明显升高，SOD活性与GSH含量明显降低，与相关文献报道结果相似［15］。说明血根碱可能通过消耗胆囊癌细胞中的SOD与GSH而降低其抗氧化能力，促进细胞发生氧化应激反应，同时产生大量活性氧进而促进丙二醛含量增加最终抑制细胞增殖。提示血根碱对胆囊癌细胞的杀伤能力与细胞内氧化应激反应存在相关性。Keap1/Nrf2/ARE信号通路是重要的抗氧化通路，信号通路关键蛋白主要为Keap1、Nrf2、HO-1，Keap1与Nrf2分离后，活化的Nrf2进入细胞核后可与ARE结合从而促进抗氧化蛋白HO-1表达［16］。研究表明多种中药有效成分可通过调控Ke⁃ap1/Nrf2/ARE信号通路从而发挥抗癌作用［17-19］。本研究结果显示血根碱处理后胆囊癌细胞中Keap1、核-Nrf2、质-HO-1蛋白表达明显降低，说明血根碱促进胆囊癌细胞凋亡可能与Keap1/Nrf2/ARE信号通路有关。提示血根碱可能通过调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路从而发挥抗胆囊癌作用。
综上所述，血根碱能够抑制胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭，诱导细胞凋亡，调节细胞内氧化应激反应，其作用机制可能与调控Keap1/Nrf2/ARE信号通路有关，这对血根碱在肿瘤防治方面的研究具有一定指导意义，可为胆囊癌治疗药物的研发提供新方向。本研究仅初步探讨血根碱对胆囊癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用及其可能的分子机制，关于其具体作用机制仍需深入研究。
猜你喜欢 胆囊癌低浓度活性氧 烟草中活性氧的研究进展现代农业科技(2022年5期)2022-12-14水环境中低浓度POPs的控制技术研究进展资源节约与环保(2022年8期)2022-09-20miR-142-5p通过CCND1调控胆囊癌细胞的增殖和转移昆明医科大学学报(2022年2期)2022-03-29近红外光照射纳米颗粒可直接产生活性氧科学导报(2022年11期)2022-03-03低浓度局麻药应用于分娩镇痛的临床研究中华养生保健(2020年9期)2021-01-18活性氧在牙周炎中病理作用的研究进展智慧健康(2020年9期)2020-12-03自噬蛋白Beclin-1在胆囊癌中的表达及临床意义中国现代医学杂志(2015年26期)2015-12-23煤矿乏风及低浓度瓦斯氧化发电技术探讨中国煤层气(2015年2期)2015-08-22胆囊癌的治疗现状医学研究杂志(2015年9期)2015-07-01改良长效低浓度骶管阻滞用于药物中期引产43例中国药业(2014年19期)2014-05-17
