橡胶树DELLA基因HbRGL1的克隆与表达分析

覃 碧 刘明洋 王 萌 王立丰 黄 飞

（1. 中国热带农业科学院橡胶研究所，海口 571101；
2. 海南大学植物保护学院，海口 570228；
3. 海南瑞橡热带经济投资集团有限公司，海口 570105）

赤霉素（gibberellin，GA）是一种植物激素，调控生长发育多个过程，包括种子萌发、茎伸长、叶片伸长和花发育等［1～3］。DELLA 蛋白作为生长抑制因子，是GA 信号传导过程起负调控作用的一类蛋白［4］。拟南芥基因组和水稻中的DELLA 蛋白在抑制GA 反应方面表现出部分重叠但截然不同的功能［5］。在拟南芥中，RGA 和GAI 是GA 促进营养生长和成花启动的主要抑制因子，RGL2 是参与种子萌发过程中主要的DELLA 蛋白，RGA、RGL1 和RGL2 均参与控制花的发育［6～7］。DELLA 蛋白丰度是通过调节GA水平来触发泛素—蛋白酶体系统介导的蛋白降解过程进行调控的。酵母三杂交试验表明GA-GID1复合物促进RGA和F-box蛋白SLY1之间的相互作用，F-box蛋白是SCFSLY1E3泛素连接酶的组成部分，其互作促使DELLA 蛋白降解。E3泛素连接酶COP1 在烟草中过表达促使DELLA 等位基因的降解，通过增加GA水平进而降低DELLA蛋白丰度［8］。DELLA 蛋白有两个结构域，分别是N端DELLA 结构域和C 端GRAS 结构域［9］。其中，DELLA 结构域对于GA 降解是必需的，但不是Fbox 蛋白结合所必需，而GRAS 结构域对DELLA 蛋白与其他蛋白的互作起关键作用。DELLA 不能结合DNA，其主要是作为转录辅激活因子［10］。

橡胶树（Hevea brasiliensisMüll.Arg.）可合成优质的天然橡胶，是不可或缺的工业原料，广泛应用于医疗卫生、交通运输以及国防建设等领域。橡胶树生长发育和产量与植物激素信号密切相关［11］。目前，生产上应用最多的产量刺激剂是乙烯利（ET）［12］。茉莉酸（JA）也有促进橡胶生物合成的作用［11］。随着分子生物技术手段的不断应用及植物激素信号转导研究取得显著进展，推动了橡胶树中植物激素信号交互的研究。在橡胶树中，赤霉素信号的关键蛋白HbRGA1［13］和HbGAI［14］已经克隆，但关于橡胶树中DELLA蛋白编码基因RGL1结构与功能尚不清楚。据此，本研究以橡胶树品种热研7-33-97为材料，克隆并鉴定HbRGL1的cDNA全长序列，对其基因序列进行鉴定及生物信息学分析，并利用荧光定量PCR技术（qRT-PCR）分析该基因的表达特征，为研究橡胶树中DELLA 蛋白家族的结构与功能提供坚实的理论基础。

1.1 实验材料

实验材料均由中国热带农业科学院橡胶研究所国家橡胶树种质资源圃提供，橡胶树品种热研7-33-97 不同组织及其不同处理后的样品采集，包括过氧化氢（H2O2）、赤霉素（GA3）、生长素（auxin，IAA）、乙烯利（ethephon，ET）、脱落酸（abscisic ac⁃id，ABA）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、水杨酸（salicylic acid，SA）、干旱和机械伤害均参照本实验室前期建立的方法进行［15］。样品统一用液氮速冻，保存于-80 ℃超低温冰箱备用，每个处理包含3次生物学重复。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成

橡胶树不同组织的总RNA提取以及反转录获得cDNA 浓度和纯度的检测均参照樊松乐等的方法进行［16］。

1.2.2 HbRGL1 cDNA全长序列的克隆

根据橡胶树基因组数据库的序列通过Primer Premier5 软件设计特异性引物HbRGL1-F 和HbRGL1-R（见表1），以反转录得到的热研7-33-97叶片cDNA 为模板，用高保真性聚合酶Phanta®Max Super-Fidelity DNA Polymerase（Vazyme，中国南京）进行扩增，反应体系：cDNA模板2 μL（～60 ng），2×Phanta Max Buffer 25 μL，dNTP Mix（10 mmol·L-1each）1 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各2 μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 补足50 μL，扩增程序为95 ℃预变性3 min；
95 ℃变性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，共33 个循环；
72 ℃延伸5 min，最后4 ℃保存。通过PCR 扩增得到HbRGL1目的条带，使用凝胶回收试剂盒（Vazyme，中国南京）参考说明书对PCR 产物进行回收，回收产物连接到TOPO-Blunt 平末端载体（上海翊圣生物科技有限公司，中国上海）后热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在含氨苄抗性培养基上培养，菌落PCR 检测后挑选阳性单克隆送广州艾基生物技术有限公司进行测序验证。

表1 HbRGL1 基因全长克隆和荧光定量PCR 扩增引物序列Table 1 Primer sequences used in full-length gene clon‐ing and qRT-PCR amplification of HbRGL1

1.2.3 HbRGL1的生物信息学分析

利 用ProtParam、NCBI Conserved Domain、MEME、SOPMA、SWISS-MODEL、TMHMM 等在线分析工具对HbRGL1 进行生物信息学预测分析［18］。利用DNAMAN 工具软件进行多序列比对。HbRGL1 蛋白通过NCBI SmartBLAST 搜索获得同源蛋白序列，然后利用MEGAX 软件构建系统进化树。

1.2.4 不同处理下HbRGL1表达模式分析

根据HbRGL1基因的ORF 设计qRT-PCR 引物（见表1），以HbACTIN（Genbank登陆号：HQ260674.1）基因为内参，进行qRT-PCR 扩增，反应体系为：

AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国南京）10 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，cDNA 1 μL（～20 ng），ddH2O 8.2 μL，在Bio-Rad荧光定量PCR 仪上进行扩增，扩增程序采用两步法：95 ℃预变性30 s，之后进行42 个循环的扩增（95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s）。基因表达量为3次生物学重复和3 次技术重复的平均值±标准误。基因相对表达结果在Excel 2016软件用2-△△Ct法［17］进行计算，采用SPSS 25 软件进行差异显著性分析，P<0.05 即为显著性差异，并采用Origin Pro 2016软件进行作图。

2.1 HbRGL1 基因的克隆及其编码蛋白的理化性质分析

以橡胶树叶片cDNA为模板，使用特异引物克隆HbRGL1的cDNA 序列，测序验证正确后将其命名 为HbRGL1并 提 交NCBI（GenBank 登 陆 号：KM086714）。HbRGL1基因cDNA长度为1 901 bp，包含1 851 bp 的ORF，编码616 个氨基酸。利用ProtParam 工具在线分析蛋白质的理化性质，结果表明HbRGL1 分子式为C2922H4599N817O922S27，蛋白质分子量为66.79 kDa，等电点为5.28，蛋白不稳定系数为46.73，脂肪系数为81.07，表明HbRGL1 为不稳定的亲水性蛋白。

2.2 HbRGL1蛋白的空间结构预测

利用NCBI Conserved Domain 进行蛋白结构域分析发现，HbRGL1 蛋白的第49-122 位氨基酸是特征性的DELLA 结构域，第249-611 位氨基酸是GRAS 结构域（见图1A 和图3）。利用MEME 在线软件分析橡胶树HbRGL1与其他植物DELLA 蛋白序列发现，它们具有3 个共同的motif（见图1B）。使用SignalP-5.0 Server 预测发现，HbRGL1 没有信号肽结构。利用SOPMA 和SWISS-MODEL 分别预测HbRGL1蛋白的二级和三级结构，结果显示α螺旋占43.90%，延长链占8.78%，β折叠占4.55%，无规卷曲占42.76%。TMHMM Server v.2.0 分析结果表明，HbRGL1 无跨膜结构。利用DeepLoc-1.0 预测HbRGL1 蛋白的亚细胞定位，发现该蛋白定位于细胞核中，其概率为0.998（见图2A）。

图1 HbRGL1蛋白的结构特征分析A.保守结构域；
B.不同物种DELLA蛋白基序预测Fig.1 Analysis of the structural characteristics of HbRGL1 A.Conserved domain；
B.Prediction of the conserved motif of DELLA proteins form different species

图2 HbRGL1的亚细胞定位预测及其系统进化树分析A.HbRGL1亚细胞定位预测；
B.不同物种DELLA蛋白进化树分析Fig.2 Subcellular localization prediction of HbRGL1 and phylogenetic analysis A.Subcellular localization prediction of HbRGL1；
B.Phylogenetic analysis of DELLA proteins of different species

图3 HbRGL1与其他植物DELLA蛋白序列比对Fig.3 Sequence alignment of HbRGL1 with other plant DELLA proteins

2.3 HbRGL1 与其他植物DELLA 蛋白的比对分析

HbRGL1 与其他植物DELLA 蛋白的系统进化关系分析表明，HbRGL1与同为大戟科（Euphorbia⁃ceae）的橡胶树HbGAIL、木薯MeGAIL、蓖麻Rc⁃GAI、麻风树JcGAI 相似性最高，聚为一类；
大豆GmDELLA1 与拟南芥AtRGA 单独聚为一类，明显区别于其他木本植物的DELLA 蛋白，木本植物与草本植物DELLA 蛋白形成了两个大的分支（见图2B），表明其功能在不同植物中出现了分化。进一步利用DNAMAN 软件对HbRGL1 及其他植物DELLA 蛋白序列进行多重序列比对分析，结果显示，HbRGL1 与其他植 物DELLA 蛋白在DELLA和GRAS 结构域的氨基酸序列高度保守，HbRGL1与HbGAIL、木薯MeGAIL、毛果杨PtGAI、拟南芥AtRGA 之间的相似度分别为90.2%、90.1%、78.0%、62%；
而不同植物的DELLA 蛋白间总体相似度达到81.4%（见图3），表明DELLA 蛋白在不同植物中具有较高的保守性。

2.4 HbRGL1基因的表达分析

通过qRT-PCR 分析HbRGL1在橡胶树不同组织中的表达模式，结果显示HbRGL1在树皮中的表达量最低；
其次是胶乳和叶片，其表达量分别为树皮中的4.2 和8.2 倍；
而在花中的表达量最高，是树皮中的18.2倍（见图4）。为了进一步解析HbRGL1基因在胁迫处理下的响应模式，本研究分析了干旱、机械伤害以及H2O2处理后HbRGL1基因的表达趋势。结果如图4所示，干旱处理显著诱导HbRGL1的表达，干旱处理后8 d 其表达量上升达到处理前（0 d）的10.1 倍。机械伤害和H2O2处理也能明显诱导HbRGL1的表达，其表达量在机械伤害后10 h达到初始0.5 h 的7.1 倍；
而在H2O2处理后6 h 其表达量是对照0 h 的7.3 倍；
以上结果表明，HbRGL1响应橡胶树干旱胁迫、机械伤害及H2O2处理。

图4 HbRGL1基因在不同组织及不同胁迫处理条件下的表达分析A.不同组织；
B.干旱胁迫；
C.机械伤害；
D.过氧化氢；
各柱形图上用不同字母表示差异显著（P<0.05），下同Fig.4 Expression analysis of HbRGL1 in different tissues and under stress treatments A.Different tissues；
B.Drought stree；
C.Mechanical wounding；
D.H2O2；
Different letters above each column means significant at P＜0.05 level，the same as below

经不同外源激素处理后的qRT-PCR 分析结果发现，HbRGL1基因表达量显著提高。结果如图5所示，在外施GA3作用下，HbRGL1基因表达被快速诱导，在0.5 h的转录水平达到了0 h的14.6倍。外施IAA 也会诱导HbRGL1的表达，分别在6 和48 h表达量出现最高值，均为0 h 的5.4 倍。外源ET 和MeJA处理后6 h，HbRGL1的表达水平均达到最高，分别为0 h 的10.6 倍和5.4。外源ABA 处理也能快速诱导HbRGL1表达，在0.5 h 的表达量就提高了4.2 倍且一直维持至10 h，24 h 快速下降，48～72 h再次上调。外施SA 处理下，HbRGL1的响应比其他激素迟缓，其表达量在48 h 出现峰值，是0 h 的6.3 倍（见图5）。这些结果表明，外源激素包括GA3、IAA、ET、MeJA 及SA可以有效地诱导HbRGL1基因的表达，其中HbRGL1对GA3的应答快速且表达量增强幅度最大。

图5 HbRGL1在不同外源激素处理条件下的表达分析A.赤霉素；
B.乙烯利；
C.茉莉酸甲酯；
D.生长素；
E.脱落酸；
F.水杨酸Fig.5 Expression analysis of HbRGL1 under treatments with different exogenous hormones A.GA3；
B.ET；
C.MeJA；
D.IAA；
E.ABA；
F.SA

植物激素信号转导过程通过关键调控因子不断调整植物的生长发育以适应不同的环境变化［18］。DELLA 蛋白是GA 信号通路的重要调控因子，属于GRAS 转录因子家族，因其具有高度保守DELLA 结构域而得名［19］。GRAS 转录因子由最早发现的3个成员GAI、RGA和SCR的特征字母而命名，在植物的生长发育与逆境胁迫响应中具有重要作用［20］。本研究从橡胶树中克隆得到一个DELLA 蛋白编码基因HbRGL1，蛋白保守结构域分析结果表明，HbRGL1 蛋白含有DELLA 和GRAS两个结构域，属于植物DELLA 蛋白家族成员。已有研究表明，DELLA 蛋白定位在植物细胞核中［21］，HbRGL1蛋白的亚细胞定位预测定位于细胞核中，与已有的研究结果一致。qRT-PCR 结果表明，HbRGL1在橡胶树所有组织中均有表达，但花中的表达量最高，表明HbRGL1在橡胶树花的发育过程中发挥重要作用。在拟南芥和葡萄的研究中也证明RGL1基因对花器官发育起关键作用［22-23］。

DELLA 除了在GA 信号通路中发挥中重要作用，还作为多个信号通路交叉互作的节点调控植物的发育过程［24］。本研究通过qRT-PCR 技术分析了HbRGL1在外源GA3、IAA、ET、MeJA 及SA 处理后的表达量，结果表明HbRGL1响应不同激素的处理。生长素与赤霉素对植物的促进作用极其相似，尤其在果实生长调节过程中的相互作用。在番茄果实发育过程中，生长素信号成分SiARF7 和激活因子SiARFs 通过不同的结构域与GA 信号抑制因子SiDELLA 反馈调控果实生长相关基因的表达，对番茄果实的形成有重要调控作用［25］。DEL⁃LA 蛋白还通过与EIN3 拮抗作用调控叶绿素的生物合成［26］。ABA 参与种子休眠的建立和维持，而GA 则促进种子萌发的诱导，GA 和ABA 发挥拮抗作用调控种子萌发过程。DELLA 蛋白与ABA 信号通路的调控因子ABI3和ABI5相互作用，从而激活靶基因SOMNUS（SOM）的转录，SOM能促进ABA的生物合成进而抑制GA的生物合成，从而抑制种子萌发［27］。JA 和GA 交叉参与植物防御系统和生长发育过程。在没有GA 的情况下，稳定的DELLA 蛋白与MYC2 竞争与JAZ 的结合，JAZs 释放MYC2，MYC2 通过与G-box 基序的结合激活JA信号途径防御基因的表达［28］。JAZ 和DELLA 的相互作用影响DELLA 调节PIFs 活性，说明JA 和GA信号拮抗作用调节植物光形态发生［29］。DELLA 蛋白同样参与SA 介导的生物胁迫和非生物胁迫过程。当植物受到病原菌侵染时，抗病调控因子EDS1 与DELLA 蛋白RGA 和RGL3相互作用，抑制SA 过度生成和过度抗性反应，通过维持植物生长和防御间的平衡［30］。在干旱条件下，GA 和SA 协同作用提高水稻应对干旱胁迫的耐受能力［31］。本研究结果表明，干旱胁迫、机械伤害、H2O2、外源激素包括GA3、IAA、ET、MeJA 及SA 可以有效地诱导HbRGL1基因的表达，推测HbRGL1参与橡胶树中多个激素信号及其交互作用过程，并通过不同信号途径及其交互作用调控橡胶树的生长发育与胁迫响应。本研究结果为进一步阐明HbRGL1调控橡胶树生长发育与胁迫响应的作用机制提供了理论基础。

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