HPLC法测定沙棘雨生红球藻胶囊中异鼠李素的含量
时间：2023-06-01 13:15:37 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
李冬冬，陈笑宇，吴香婷，赵诗聪，朱日，刘英链，杨锦竹※，金向群※
（1.吉林大学药学院，吉林 长春 130021；
2.吉林省正和药业集团股份有限公司，吉林 通化 134001）
氧化还原平衡是人体健康的基础，也谓本。随着人们生活压力的增大以及受各种外界环境的影响，人体会产生自由基堆积，其引起的氧化胁迫可引起一系列如衰老、肿瘤、自身免疫性疾病以及一些慢性退行性疾病等，因此从失衡损伤源头切入，及时补充抗氧化剂来帮助自身达到氧化还原平衡是十分必要的。
沙棘雨生红球藻胶囊是由沙棘、雨生红球藻粉以及玉米淀粉等辅料制成的具有抗氧化功能的保健食品。在2020年版《中国药典》（一部）中记载，沙棘为胡颓子科植物沙棘（Hippophae rhamnoides L.）的干燥成熟果实[1]，性温，味微酸，归脾、胃、肺、心经，为蒙古族、藏族常用药材，现作为一种药食同源的植物被广受关注。沙棘果实中含有多种生理活性物质，如黄酮类、多酚类、油脂、多种维生素和微量元素等[2]，具有健胃消食[3]、止咳祛痰[4]、抗炎镇痛[5]、降血脂[6]、抗疲劳[5]和抗氧化[7-9]等功效。
沙棘中含有丰富的以异鼠李素、槲皮素和山柰酚为母核的黄酮类化合物，研究表明，沙棘黄酮具有清除人体内自由基和阻断过氧化作用[10]，并能使SOD的活性提高[11]，预防心血管疾病的发生，保护并促进细胞的健康生长[12]，被视为是一种良好的活性氧清除剂。沙棘黄酮中以异鼠李素的含量最为丰富[13]，有相关研究[14-18]也报道了关于异鼠李素的含量测定方法，将异鼠李素作为沙棘质量控制的标志性成分。本实验拟采用高效液相色谱法（HPLC）建立沙棘雨生红球藻胶囊中异鼠李素含量的测定方法，该法准确可靠、简单易行且分离度高，可为沙棘雨生红球藻胶囊的开发和研究提供参考。
1.1 试剂与材料
异鼠李素对照品（批号I109591），购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
沙棘雨生红球藻胶囊为实验室自制；
甲醇、磷酸为色谱纯（美国Fisher试剂公司）；
乙醇、盐酸为分析纯（吉林省金泰化玻有限公司）。
1.2 仪器
Acchrom S3000高效液相色谱仪（华普科技有限公司）；
Sartorius BT 25S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；
HH-Z数显恒温水浴锅（上海力辰邦西仪器科技有限公司）。
1.3 溶液的配制
1.3.1 对照品溶液的配制 精密称定异鼠李素，适量甲醇溶解并定容至刻度线，以此配制成浓度为14.6g/mL的溶液，即得。
1.3.2 供试品溶液的配制 取沙棘雨生红球藻胶囊内容物适量，在研钵中研细，精密称取约2 g，置于具塞烧瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定，用95%乙醇补足减失的重量，滤过取续滤液25 mL，加入盐酸3.5 mL，75℃水浴1 h，立即冷却，转移至50 mL容量瓶中，加入适量95%乙醇并定容至刻度线，摇匀滤过即得[1]。
1.3.3 缺沙棘阴性对照液的配制 取缺沙棘阴性样品适量，按“1.3.2”所述方法进行处理，即得。
1.4 色谱条件
色谱柱：Inert Sustain Swift-C18柱（4.6 mm 250 mm，5m）；
流动相：甲醇-0.4%磷酸溶液（56:44）；
流速：1 mL/min；
检测波长：370 nm；
柱温：25℃；
进样量：10L。
2.1 专属性考察
将“1.3”项下异鼠李素对照品溶液、沙棘雨生红球藻胶囊供试品溶液和沙棘阴性对照液3种溶液，注入HPLC仪器中进行测定，色谱图见图1。本方法专属性良好，17 min处出现目标峰，且供试品中目标峰与相邻峰达到基线分离，无杂峰的影响；
阴性对照液在该保留时间处无干扰峰，符合要求。
图1 沙棘雨生红球藻胶囊高效液相色图谱Fig.1 HPLC of Shaji Haematococcus pluvialis capsules
2.2 线性关系考察
精密量取“1.3.1”项下对照品溶液3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL和8 mL分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至相应刻度，摇匀，得到浓度分别为0.004 38 mg/mL、0.005 84 mg/mL、0.007 30 mg/mL、0.008 76 mg/mL、0.010 22 mg/mL和0.011 68 mg/mL的对照品标准系列工作液，进样测定，数据见表1。以峰面积为纵坐标，异鼠李素的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图2。异鼠李素的质量浓度在0.004 38 mg/mL到0.011 68 mg/mL范围内呈现良好的线性关系，回归方程为y=29 510.765x+34.115，R2=0.999 4。
图2 异鼠李素标准曲线Fig.2 The standard curve of isorhamnetin
表1 线性试验结果Table 1 Results of the linear
2.3 精密度考察
将“1.3.1”项下异鼠李素对照品溶液稀释后，连续进样6次，每次精密吸取10L，结果求得峰面积的RSD=0.72%＜2%（n=6），表明仪器精密度良好。
2.4 重复性考察
取沙棘雨生红球藻胶囊的内容物，按“1.3.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，进样体积为10L，计算含量，供试品中所含的异鼠李素质量浓度的RSD值为0.52%＜2%（n=6），本法重复性良好。
2.5 溶液稳定性考察
吸取同一份供试品溶液，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h和24 h时注入色谱仪进行测定，计算得到在24 h内异鼠李素峰面积的RSD为0.68%＜2%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.6 加样回收试验
精密称定已知异鼠李素含量的沙棘雨生红球藻胶囊内容物粉末6份，各1.0 g，再加入等量的异鼠李素对照品，按照“1.3.2”项下方法制备，进样测定并分析，计算各样品中异鼠李素的回收率，见表2。
表2 回收率试验结果Table 2 Recovery results
2.7 样品测定
从3个批次不同的沙棘雨生红球藻胶囊中各取3个平行样，按照“1.3.2”项下方法进行供试品处理，进样测定，计算得到异鼠李素的含量均值分别为45.41 mg/100 g、44.72 mg/100 g和45.66 mg/100 g，9个样品的RSD=0.73%＜2%，说明此方法可用于测量异鼠李素的含量，且较为准确、可靠。
3.1 讨论
本试验曾将沙棘雨生红球藻胶囊内容物经乙醇提取后不进行酸水解处理，测得的异鼠李素含量远低于酸水解组，因此，本产品中的异鼠李素主要以苷的形式存在，进行酸处理能够使苷充分水解转化为苷元[19]，使得测定结果更加准确；
参照药典的流动相条件甲醇-0.4%磷酸溶液（58:42）[1]进行实验时，发现异鼠李素分离度较差，与相邻峰未达到基线分离，于是将流动相的极性比例微调，调整至甲醇-0.4%磷酸溶液为（56:44），延长了异鼠李素的保留时间，并将进样体积由20L 降低至10L，最终使异鼠李素的分离度大大改善，有效避免了杂峰的影响。
3.2 结果
本试验采用高效液相色谱法（HPLC）建立了沙棘雨生红球藻胶囊中异鼠李素含量的测定方法并对其进行了方法学考察，异鼠李素在0.004 38 mg/mL～0.011 68 mg/mL质量浓度范围内线性良好，线性回归方程为y=29510.765x+34.115，R2=0.999 4；
方法学考察结果良好，回收率在96.43%～98.98%范围内，平均加样回收率值为97.42%，RSD=0.89%（n=6）。另外，此分析方法得到的异鼠李素色谱峰峰形尖锐、对称，保证了定量的准确性。综上可知，该方法可用于沙棘雨生红球藻胶囊中异鼠李素的含量测定，可为其后续的开发和研究提供参考。
