钙化性主动脉瓣膜病的生物标志物预测模型的构建

杨 玲， 查 晴， 张倩茹， 叶佳雯， 杨 克， 刘 艳

（1.上海交通大学医学院附属第九人民医院心血管内科，上海 200011；
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院心血管内科，上海 200025）

钙化性主动脉瓣膜病（calcific aortic valve disease，CAVD）作为常见的心血管疾病，其主要以主动脉瓣膜及其周围组织发生纤维化、硬化、钙盐沉积为特征[1-2]，并逐渐进展为主动脉瓣膜狭窄（aortic stenosis），而严重狭窄可致主动脉血流动力学改变，并引起左心室超负荷，严重者可导致死亡。主动脉瓣膜硬化（aortic valve sclerosis）是CAVD的亚临床表现，是一种无症状的主动脉瓣增厚和钙化，没有血流动力学改变[3]。CAVD的患病率逐年上升，据估计，在美国65岁以上的人群中有25%～30%存在主动脉瓣膜硬化，并以每年2%的速度发展为主动脉瓣膜狭窄[4-5]。虽然，针对主动脉瓣膜硬化的诊断可通过临床影像学方法，但影像学对疾病较早期患者预测价值较差，若能在较早期预测CAVD患者，将为临床医师提供更好的疾病预防和管理指导。为提供早期及时的诊断，新兴生物标志物的发现为CAVD的风险分层和干预时机提供了一种潜在的补充方法[6]。有文献根据既往的研究结果，总结了可用于预测CAVD的严重程度、进展和预后价值的潜在生物标志物，如胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）、骨 桥 蛋 白(osteopontin,OPN)、瘦素（leptin）、胎球蛋白（fetuin A）等[7]。本文旨在探究GLP-1、OPN和CAVD的关系，并基于此设计一种预测模型，用于预测CAVD。

一、一般资料

选取2012年1月至2014年8月于上海交通大学医学院附属瑞金医院（瑞金医院）心内科住院患者（n=816），排除具有急性期感染（n=48）、风湿性心脏瓣膜病（n=10）、既往行主动脉瓣置换术（n=33）、原发性心肌病（n=35）、感染性心内膜炎（n=10）、恶性肿瘤（n=22）、先天性心脏病（n=16）、自身免疫性疾病（n=14）、正在接受抗骨质疏松治疗（n=17）、估算的肾小球滤过率（estimate glomerular filtration rate，eGFR）＜30 mL/（min·1.73 m2）（n=30）、没有心脏超声影像学数据（n=51）、病史资料不全（n=55）和拒绝进入研究（n=29）患者，最后共纳入患者446例，通过SPSS20.0将患者按简单随机法分为筛查队列（n=202）和验证队列（n=244）。CAVD被定义为不透明小叶，超声提示主动脉瓣瓣膜局部区域增厚或回声增强，伴或不伴有经主动脉瓣流速峰值升高（≥2 m/s）[8]。本研究方案经瑞金医院伦理委员会审核通过，且所有患者签署知情同意书，伦理批准书编号为（2016）临伦审第（58）号。

二、临床资料采集

收集2个队列患者的临床资料，包括年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟和饮酒基本资料，既往是否有高血压、糖尿病、冠心病（coronary heart disease,CAD）病史，以及空腹血糖、总胆固醇 （total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇 （low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇 （high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、γ-谷氨酰转移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、血肌酐（creatinine，Cr）、eGFR等实验室检查数据，降糖药物使用情况及他汀类药物使用情况。

三、样本采集及生物标志物检测

所有受试者采集空腹静脉血，并使用乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA）抗凝。4℃1 500×g离心15 min，分离并收集血浆于-80℃冰箱中保存待用。血浆标本通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清GLP-1（美国Abcam公司）及OPN（美国Abcam公司）浓度。检测流程严格按照试剂盒内说明书进行操作。

四、年龄及性别分组

将研究人群按照性别分为男性组和女性组，按年龄分为青中年组（年龄＜65岁）和老年组（年龄≥65岁）2组，测试生物标志物模型对不同性别和年龄组的预测能力。

五、统计学方法

采用SPSS 20.0及R语言统计学软件进行统计分析。应用Kolmogorov-Smirnov/Shapiro-Wilk检验及直方图对数据进行正态性检验，正态分布计量资料采用±s表示，非正态分布计量资料采用中位数、四分位间距[M（Q1，Q3）]表示，计数资料采用例（%）表示。正态分布计量资料组间差异比较采用两独立样本的t检验，非正态分布计量资料组间差异比较采用非参数检验Mann-Whitney U检验，计数资料组间差异采用2×2χ2检验。P＜0.05视为差异有统计学意义。在筛查队列中，采用SPSS 20.0中的二元Logistic回归（向前选择法）分析GLP-1、OPN以及各临床指标和CAVD之间的关系，确定纳入模型的变量，再通过R语言统计软件，采用二元Logistic回归构建预测CAVD模型，并绘制Nomogram列线图。采用受试者工作特征（receiver-operating characteristic，ROC）曲线分析评价模型在筛查队列和验证队列中的的区分能力，计算曲线下面积（area under the curve，AUC），此值与C统计量相当[9]。在筛查队列和验证队列中行Hosmer-Lemeshow检验评估模型的一致性（P＞0.05视为模型拟合良好），并绘制校准曲线[10]。

一、2队列临床基本特征

筛查队列的202例患者中，CAVD患者共103例（51.0%），非CAVD患者99例（49.0%）。相比于非CAVD组，CAVD组年龄大、CAD患者占比高，BUN、Cr更高，而eGFR、GLP-1、OPN低（均P＜0.05）。性别、BMI、吸烟、饮酒、GGT、TC、TG、LDL-C、HDLC、空腹血糖、糖尿病及高血压2组间差异无统计学意义（见表1）。验证队列244例患者中，CAVD患者共119例（48.8%），非CAVD患者125例（51.2%），与非CAVD组相比较，CAVD组除年龄大、CAD患者占比高，BUN、Cr更高，eGFR、GLP-1、OPN低（均P＜0.05）外，CAVD组TC、TG、LDL-C、HDL-C显著低于非CAVD组（均P＜0.05），高血压患者占比高（P＜0.05）；
而性别、BMI、吸烟、饮酒、GGT、空腹血糖、糖尿病差异无统计学意义（见表2）。

表2 验证队列患者临床基本资料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

表2 验证队列患者临床基本资料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

指标 非CAVD（n=125） CAVD（n=119） t/U/χ2 P男性[n（%）] 69（55.2） 71（59.7） 0.497 0.481年龄(岁) 59.26±9.32 74.08±7.92 -13.357 0.000 BMI（kg/m2) 24（23，27） 25（23，28） -1.090 0.276饮酒[n（%）] 15（12.0） 7（5.9） 2.781 0.095吸烟[n（%）] 42（33.6） 27（22.7） 3.578 0.059 GGT（U/L） 20（14，33） 21（14，30） -0.147 0.883 TG（mmol/L） 1.44（1.12，2.08） 1.21（0.94，1.77） -3.213 0.001 TC（mmol/L） 4.20±1.02 3.81±1.10 2.885 0.004 HDL-C（mmol/L） 1.09（0.92，1.29） 1.04（0.91，1.19） -1.992 0.046 LDL-C（mmol/L） 2.35（1.82，3.08） 2.07（1.65，2.76） -2.390 0.017空腹血糖（mmol/L） 4.82（4.49，5.59） 4.94（4.55，5.86） -0.682 0.495 BUN（mmol/L） 5.1（3.9，6.1） 5.9（4.7，7.0） -3.451 0.000 Cr（μmol/L） 72（62，85） 82（69，96） -3.967 0.000 eGFR[mL/（min·1.73m2）] 87.71±28.09 62.62±18.19 8.237 0.000糖尿病[n（%）] 40（32.0） 33（27.7） 0.530 0.467高血压[n（%）] 78（62.9） 91（76.5） 5.278 0.022 CAD[n（%）] 93（74.4） 104（87.4） 6.620 0.010降糖药物治疗[n（%）] 24（19.2） 15（12.6） 1.974 0.160他汀类药物[n（%）] 109（87.2） 94（79.0） 2.938 0.087 GLP-1（ng/L） 14.58（9.82，18.74） 11.82（7.62，15.96） -3.108 0.003 OPN（ng/L） 5 242.36（3 732.77，6799.75） 3 941.64（1 469.97，7067.90） -2.937 0.003

二、血清生物标志物与CAVD相关性分析

2队列中相较于非CAVD组，GLP-1和OPN浓度在CAVD组均显著性降低（P＜0.01）（见表1、2）。在筛查队列中，Logistic回归分析显示，年龄、吸烟、HDL-C、GLP-1及OPN与CAVD发病显著相关（均P＜0.05）（见表3）。因此，将HDL-C、GLP-1及OPN这3个血清标志物作为构建预测CAVD生物标志物模型的变量。

表1 筛查队列患者临床基本资料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

表1 筛查队列患者临床基本资料[±s/n（%）/M（Q1，Q3）]

指标 非CAVD（n=99） CAVD（n=103） t/U/χ2 P男性[n（%）] 54（54.5） 64（62.1） 1.197 0.274年龄（岁） 60.19±8.24 73.44±7.65 -11.845 0.000 BMI（kg/m2） 24（22，26） 25（23，27） -1.366 0.172饮酒[n（%）] 14（14.1） 11（10.7） 0.558 0.455吸烟[n（%）] 24（24.2） 26（25.2） 0.027 0.869 GGT（U/L） 19（13，35） 21（16，28） -0.819 0.413 TG（mmol/L） 1.48（1.15，2.10） 1.43（1.02，2.14） -0.612 0.541 TC（mmol/L） 4.04±1.13 4.02±1.22 -0.119 0.906 HDL-C（mmol/L） 1.14（0.94，1.33） 1.08（0.90，1.24） -1.670 0.191 LDL-C（mmol/L） 2.34（1.72，2.77） 2.42（1.76，2.92） -0.479 0.584空腹血糖（mmol/L） 5.1（4.57，5.84） 5.1（4.70，5.90） -0.053 0.958 BUN（mmol/L） 5.0（4.2，5.7） 5.6（4.5，6.7） -2.647 0.008 Cr（umol/L） 73（63，84） 82（71，97） -4.162 0.000 eGFR[mL/（min·1.73m2）] 85.69±21.22 65.50±23.69 6.370 0.000糖尿病[n（%）] 35（35.4） 33（32.0） 0.248 0.618高血压[n（%）] 66（66.7） 79（76.7） 2.508 0.113 CAD[n（%）] 65（65.7） 88（85.4） 10.750 0.001降糖药物治疗[n（%）] 16（16.2） 13（12.6） 0.515 0.473服用他汀类药物[n（%）] 75（75.8） 88（85.4） 3.036 0.081 GLP-1（ng/L） 14.6（9.43，20.50） 11.14（7.68，13.84） -3.543 0.000 OPN（ng/L） 5 374.07（4 248.37，7 030.09） 4 391.5（1 496.13，7 436.65） -2.650 0.008

表3 二元Logistic回归分析各临床变量及生物标志物与CAVD间关系

考虑到OPN的比值比（odds ratio，OR）值接近于1，将OPN根据其浓度按值升序分为十等分，使其由计量资料转换为有序分类资料纳入模型。

三、基于生物标志物及临床变量的CAVD预测模型的构建及验证

在筛查队列中，根据已经得到的3个变量，采用二元Logistic回归构建预测CAVD模型，并绘制Nomogram列线图（见图1）。如图2A和B所示，模型在筛查队列及验证队列均具有良好的鉴别能力，在筛查队列中C统计量为0.73[95%置信区间（confidence interval,CI）：0.66～0.80]，在验证队列中C统计量为0.70（95%CI：0.64～0.77）。Hosmer-Lemeshow检验显示，在2个队列中模型均拟合良好（筛查队列：P=0.14，验证队列：P=0.23），并绘制校准曲线（见图2C和D），可发现模型在筛查队列及验证队列均具有良好的一致性。

图1 基于生物标志物的CAVD预测模型

图2 生物标志物模型对CAVD的预测评估

将GLP-1、OPN和HDL-C从相应的浓度值向上划一条直线到“分值”线。根据3种生物标志物的累积分值，在列线图的“总分值”线与“CAVD发病率”线之间画一条向下的垂线，计算CAVD发病率。

决策曲线分析（decision curve analysis,DCA）曲线可发现，不论是在筛查队列还是验证队列中，新的生物标志物模型均较临床因素模型净效益增加（见图3A和B）。

图3 生物标志物模型与临床危险因素模型DCA曲线

四、年龄/性别分层比较分析

不论是筛查队列还是验证队列，生物标志物模型在不同性别和年龄组中均表现良好。其中，在性别分层分析中，预测模型对男性患者具相对更好的预测能力；
在年龄分层分析中，预测模型对中青年组仍具良好预测能力（见表4）。

表4 在年龄、性别分层组中生物标志物模型预测CAVD表现

既往研究表明，CAVD临床危险因素包括性别、肥胖、高血压、糖尿病、吸烟，其中男性、罹患高血压、糖尿病、肥胖、吸烟史患者CAVD发病风险更高[11]。因此，采用DCA比较新的生物标志物模型（包括GLP-1、OPN和HDL-C）相比临床危险因素模型（包括性别、BMI、糖尿病史、高血压史及吸烟史）在筛查队列和验证队列中的净收益[12]。年龄与CAVD发病呈现高度相关性，此外，研究中男性患者占比更高，既往研究也表明性别和年龄对CAVD的发生发展具有重要影响[13]。在本研究中，基于R语言和逻辑回归的结合，开发并验证了一种新的生物标志物模型，包含GLP-1、OPN及HDL-C，用于预测CAVD。该模型在筛查和验证队列以及不同年龄、性别组中均表现出良好的鉴别能力。目前对于CAVD仍缺乏敏感和特异的早期诊断和延缓进展的方法，不少研究尝试使用他汀类药物、血管紧张素转换酶抑制剂来延缓CAVD进展均以失败而告终[14-15]。对于CAVD的治疗仅限于主动脉瓣置换术以挽救疾病严重阶段患者，因此，需寻找新的生物标志物并探究可能的药理学靶点。本研究为CAVD早期诊断及可能的治疗靶点提供了一种方向。

既往也有不少GLP-1、OPN、HDL与CAVD的相关性研究[16-18]，但主要集中在单个生物标志物和CAVD之间的关联。CAVD的发生发展过程涉及多种机制参与，多因子协同评估能取得更好的效果。本研究联合探究了GLP-1、OPN以及HDL-C和CAVD的关系，发现不论是在筛查队列还是验证队列，这三者在CAVD组的血浆水平较非CAVD组均明显降低，而针对GLP-1和HDL-C，目前临床上已有调节其水平相关的药物，提高GLP-1或HDL-C水平也许能成为未来CAVD治疗的药理学靶点[19]。此外，本研究观察到CAVD组OPN水平较非CAVD组降低，似乎和既往一些研究结论相反，这可能归因于以下3点：①检测的OPN浓度是血清浓度而非瓣膜中的浓度；
②OPN翻译后修饰对其生物学功能具有很大的影响[20]，而本研究检测的是血清中的总OPN浓度，可能对结果造成一定影响；
③本研究入选人群均为心血管内科住院患者，其中大多数是CAD患者，受试者来源可能对结果造成一定影响。因此，OPN在CAVD中的作用还有待进一步研究，在未来研究中应该将修饰后OPN水平考虑在内。

本研究虽然尝试并成功构建CAVD的生物标志物预测模型，但是该预测模型需在多中心或大样本量人群加以验证，这是该疾病预测模型未来研究方向，同时也是本研究的局限性。此外，随着CAVD临床及基础进一步深入研究，可发现其他更多新型标志物，而这些指标的纳入将进一步完善CAVD预测模型，因此，针对新的生物标志物的研究也是未来研究方向之一。

综上所述，本研究成功构建并验证了一种预测CAVD的模型，该模型的鉴别能力和准确性均表现良好，甚至在年轻患者中仍表现出了良好的预测能力，这使临床医师能够早期识别高风险CAVD患者，为临床干预时机和治疗策略提供有力指征。

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