应用不同消毒方法清除新型冠状病毒核酸污染的效果观察
时间：2022-12-10 16:45:02 来源：雅意学习网 本文已影响 人 
安 超，施嘉楠，何瑞芬，马 雯，朴文花
（1.宁夏回族自治区人民医院检验科，宁夏银川 750001；
2.宁夏医科大学临床医学院，宁夏银川 750004）
1985年，美国MULLIS等发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）,并因此于1993年获得诺贝尔化学奖，而基于PCR的检测技术因其灵敏度高、特异性强、检测时间短而广泛应用于临床感染性疾病诊断、耐药基因检测、遗传病诊断和肿瘤性疾病诊断等[1-4]。2020年6月，国务院颁发的《关于加快推进新冠病毒核酸检测的实施意见》中指出加强二级以上医院建设，使各地逐步达到新型冠状病毒（新冠病毒，2019-nCoV）核酸检测条件。由于各地新冠病毒核酸检测人员业务水平参差不齐以及核酸检测技术超高的灵敏度，使得核酸污染难免发生。2020年4月，美国疾病控制与预防中心实验室因发生核酸污染，导致全美2019-nCoV核酸检测延迟6周左右。2021年1月，我国北方某小镇因核酸污染致多人检测结果假阳性。2021年2月湖北南漳县人民医院因核酸检测试剂污染致医院停诊。一旦发生核酸污染，不仅浪费大量人力、财力，严重者还可能导致实验室瘫痪。因此，临床迫切需要有效的清除核酸污染的方案。本研究比较临床常用的消毒方法对核酸污染的清除效果，旨在为各地2019-nCoV核酸检测可能出现核酸污染进行防控提供参考。
新冠病毒核酸检测靶基因O基因即ORF1ab（开放阅读框架1ab）基因，N基因即（nucleocapsid，N）核衣壳蛋白基因，均为新冠病毒高度保守靶基因。内标片段IC基因即人核糖核酸酶P（ribonuclease,RNaseP,RNase P基因)为内源性内标（人源性内标），全程监测新冠核酸采样和核酸提取及PCR反应过程，避免假阴性发生。本研究通过不同消毒方法处理污染区后，监测新冠病毒ORF1ab和N基因及内标片段IC基因扩增结果Ct值变化，用于评估各消毒方法对2019-nCoV核酸污染的清除效果。
1.1 试剂与仪器
2019-nCoV核酸检测试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司，PCR Cleaner购自朗司医疗科技有限公司，750 mL/L酒精（乙醇）购自利尔康医疗科技有限公司，含氯消毒剂购自朗索医用消毒剂有限公司。核酸检测使用ABI 7500实时荧光定量PCR仪。
1.2 不同消毒方法清除核酸污染效果的检测
用医用棉拭子将50μL 2019-nCoV阳性质控品均匀涂抹于塑料、金属、玻璃，晾干后，分别分为对照组（未使用任何消毒方法处理）和实验组，即分别滴加50μL的750mL/L乙醇、含氯消毒剂（2000、5500mg/L）、PCR Cleaner，作用1 min，然后用医用棉拭子擦拭已消毒的相应原污染区后，浸泡于300μL纯水中，震荡混匀后，取5μL进行实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测。每个实验重复3次。
总反应体系为25μL，PCR扩增模板5μL，反应条件按照试剂说明书进行，分别检测各组的ORF1ab和N基因及内标片段IC基因表达。统计各组扩增后2019-nCoV扩增靶区域ORF1ab和N基因及内标片段IC基因Ct值，评估核酸污染清除效果。
1.3 紫外线不同照射时间对核酸污染清除效果的检测
用医用棉拭子将50μL 2019-nCoV阳性质控品均匀涂抹于塑料、金属、玻璃，晾干后分别在紫外灯下垂直照射0、1、2、3、4、5 h，然后用医用棉拭子擦拭后浸泡于300μL纯水中，震荡混匀后取5μL RT-qPCR扩增检测。每个实验重复3次。同1.2项中所用方法进行检测。
2.1 不同消毒方法对塑料表面2019-n CoV核酸污染清除效果的比较
不同方法消毒塑料表面2019-nCoV核酸污染后，原污染区的ORF1ab和N基因及内标片段IC基因扩增Ct值结果：2 000 mg/L含氯消毒剂=5 500 mg/L含氯消毒剂＜对照组＜750 mL/L乙醇＜PCR Cleaner，对照组与实验组Ct值差异具有统计学意义(P＜0.05，表1)。
表1 RT-q PCR测定塑料表面2019-n CoV核酸污染区经不同方法消毒后各相关基因的Ct值结果Tab.1 Ct values of relevant genes in 2019-nCoV nucleic acid contaminated area on plastic surface determined by RT-qPCR after disinfection with different methods （n=3）
2.2 不同消毒方法对金属表面新冠病毒核酸污染清除效果的比较
不同方法消毒金属表面2019-nCoV核酸污染后，原污染区的ORF1ab和N基因及内标片段IC基因扩增Ct值结果：2 000 mg/L含氯消毒剂=5 500 mg/L含氯消毒剂＜对照组＜750 mL/L乙醇＜PCR Cleaner，对照组与实验组Ct值比较差异具有统计学意义(P＜0.05，表2)。
表2 RT-q PCR测定金属表面2019-nCoV核酸污染区经不同方法消毒后各相关基因的Ct值结果Tab.2 Ct values of relevant genes in 2019-nCoV nucleic acid contaminated area on metal surface determined by RT-qPCR after disinfection with different methods （n=3）
2.3 不同消毒方法对玻璃表面2019-n CoV核酸污染清除效果的比较
不同方法消毒玻璃表面2019-nCoV核酸污染后，原污染区的ORF1ab和N基因及内标片段IC基因扩增Ct值结果：2 000 mg/L含氯消毒剂=5 500 mg/L含氯消毒剂＜对照组＜750 mL/L乙醇＜PCR Cleaner，对照组与实验组Ct值比较差异具有统计学意义(P＜0.05，表3)。
表3 RT-q PCR测定玻璃表面2019-nCoV核酸污染区经不同方法消毒后各相关基因的Ct值结果Tab.3 Ct values of relevant genes in 2019-nCoV nucleic acid contaminated area on glass surface determined by RT-qPCR after disinfection with different methods （n=3）
2.4 紫外线照射清除2019-n CoV核酸污染效果
紫外线不同照射时间消毒2019-nCoV核酸污染区后，原污染区的ORF1ab和N基因及内标片段IC基因扩增Ct值结果：紫外线照射3 h=紫外线照射4 h=紫外线照射5 h=0＜对照组＜紫外线照射1 h＜紫外线照射2 h，对照组与实验组Ct值比较差异具有统计学意义(P＜0.05，表4)。
表4 RT-q PCR测定紫外线照射2019-nCoV核酸污染区后各相关基因的Ct值结果Tab.4 RT-qPCR was used to determine the Ct value of related genes in the nucleic acid contaminated area of 2019-nCoV after ultraviolet irradiation （n=3）
2019-nCoV核酸检测试剂盒阳性质控品一般为含新型冠状病毒目的片段和内标片段的假病毒，其操作和处理应视为具有传染性的物质。在目前新冠肺炎疫情常态化防控形势下，阳性质控品核酸污染往往是导致检测结果假阳性和实验室污染的主要原因。因此，避免阳性质控品核酸污染是顺利开展核酸检测工作的先决条件[5]。
国家卫健委指出在进行新冠核酸检测前需使用750 mL/L乙醇或2 000 mg/L含氯消毒剂对标本转运箱、标本转运桶内壁、标本密封袋、桌面、台面及地面进行消毒，标本采集管使用2 000 mg/L含氯消毒剂消毒，如有渗漏用吸水纸覆盖后5 500 mg/L含氯消毒剂处理；
核酸检测和提取尽可能在生物安全柜内进行；
实验结束后使用750 mL/L乙醇或2 000 mg/L含氯消毒剂对实验台面、地面和生物安全柜等消毒，并用紫外灯照射2 h以上[6]。
含氯消毒剂主要是通过产生分子量很小的并且具有强氧化作用的次氯酸，通过强氧化作用将核酸直接裂解。本研究结果表明，2 000 mg/L和5 500 mg/L含氯消毒剂均能完全清除塑料、金属和玻璃上的核酸污染，值得在新冠核酸检测实验室推广应用。陈茂义等[7]使用RT-qPCR方法检测结果同样表明，含氯消毒剂能够完全破坏新型冠状病毒核酸，并且效果与含氯消毒剂的浓度和作用时间呈正相关。但是由于含氯消毒剂的强氧化作用，所以对于金属及其他精密仪器建议使用PCR Cleaner或750 mL/L乙醇等。
PCR Cleaner是一种专门用于清除核酸污染的无腐蚀性溶液，由A液和B液构成。A液通过改变核酸表面电荷分布，使其从被污染的物体表面脱落，并结合物理擦拭和B液的非酶水解作用达到清除核酸污染的消毒效果。本研究结果表明，PCR Cleaner也可以较明显地清除塑料、金属和玻璃上核酸污染，其清除效果仅次于含氯消毒剂，并且由于其无刺激性和腐蚀性在实际工作中更受青睐。
医用乙醇一般为700～750 mL/L。乙醇通过使病原微生物的蛋白质变性达到消毒效果。当使用的乙醇浓度过高时，菌体表面会形成一层荚膜来阻止乙醇进一步破坏其内部结构，而当使用的乙醇浓度过低时，也会因为乙醇的挥发作用等导致消毒效果不理想。乙醇可通过物理沉降和非直接破坏作用达到抑制或清除核酸污染的效果[8-9]。本研究结果表明，750 mL/L乙醇对核酸污染的消毒效果弱于含氯消毒剂和PCR Cleaner，可能与其清除核酸污染的机制有关。
紫外线通过诱导微生物核酸中的胞嘧啶和胸腺嘧啶为嘧啶二聚体，直接破坏其核酸结构达到日常消毒和清除核酸污染的效果[10-12]。常用的紫外线消毒光谱有254 nm和185 nm。185 nm紫外线可将空气中的氧气转变为具有强氧化作用的臭氧，臭氧通过直接破坏病原微生物核酸达到消毒效果。臭氧的弥散作用弥补了紫外线只能直线消毒的不足。Ct值为荧光信号达到阈值时的循环数，与初始模板浓度成反比。本研究结果表明，紫外线照射1 h可明显减弱新冠病毒ORF1ab和N基因及内标片段IC基因核酸污染，之后每增加1 h，Ct值约增加2。紫外线照射3 h可以完全清除2019-nCoV ORF1ab和N基因及内标片段IC基因核酸污染。因此，在每次核酸检测完成后，建议工作区紫外线照射至少3 h。
本研究尚存在不足之处：第一，重复实验次数偏少，未进行大规模实验观察，因此对于符合研究条件的医疗科研机构可以扩大样本量进行进一步研究。第二，本研究未深入研究各种消毒方法清除2019-nCoV核酸污染作用机制。第三，本研究采用的是2019-nCoV核酸检测试剂盒中的阳性质控，其本质是人工合成的含有2019-nCoV核酸序列的假病毒，而未对具有生物活性的新冠病毒核酸污染进行研究。
综上所述，本研究发现2 000 mg/L和5 500 mg/L含氯消毒剂能够完全清除塑料、金属和玻璃材质上2019-nCoV核酸污染，PCR Cleaner清除效果次之，750 mL/L乙醇效果最差。紫外线照射1 h可以明显清除2019-nCoV核酸污染，照射3 h可以完全清除污染。
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