Streptomyces,sp.KC17012次生代谢产物及抗菌活性研究

何江波，康大伟，陈 秀，王纪爱，王 涛，毕晓旭，栾 杰，曹艳茹*

1昆明学院医学院，昆明 650214；
2云南省疾病预防控制中心理化检测中心，昆明 650022

链霉菌属于革兰氏阳性菌，原核生物界、放线菌目(Actinobacterales)、链霉菌科(Streptomycetaceae)、链霉菌属(Streptomyces)。链霉菌是一类重要的微生物资源，主要存在于土壤、海洋、淡水等生态系统中，被广泛应用于药物研究，农业杀虫剂、除草剂等方面[1]。链霉菌具有神奇的创造功能，可以产生大量结构新颖且具有较好生物活性的次生代谢产物，且多数代谢产物为含氮类型的化合物。据统计，在目前发现的微生物活性产物中，由链霉菌产生的次生代谢产物约占总数的2/3[2]。医学应用的抗生素多为链霉菌代谢产物，如氨基糖苷类抗生素等，这些抗生素在医学及农业生产中发挥着举足轻重的作用[3]。近年来，随着普通环境微生物的研究日渐成熟，特殊环境微生物，例如海洋、火山口、极地等极端环境成为研究的热点。Li等[4]从海洋链霉菌HS-34中分离得到具有抗副溶血性弧菌的化合物。Ye等[5]从广西红树林土壤中分离得到两株链霉菌，并发现两株菌的次生代谢产物均对金黄色葡萄球菌具有较好的抑制作用；
Zhou等[6]从极地真菌GeomycespannorumSA3-2-YM的次级代谢产物中发现具有肿瘤细胞毒活性的环二肽化合物。链霉菌KC17012是我们课题组从东川铜矿土中分离得到，通过菌株形态与特征，结合16S rRNA基因的系统进化分析，确定该菌株为一株新菌株(GenBank number:MW526995)。因此，我们课题组继续对Streptomycessp.KC 17012进行深入研究，旨在阐明其次生代谢产物，为该菌的深入开发奠定基础。

1.1 仪器与试剂

质谱仪(美国Agilent 6500系列Q-TOF LC/MS)；
核磁共振仪(Avance 600 MHz，TMS 作为内标，δ为ppm，J为Hz)；
制备液相(江苏汉邦，Hanbon-NP 7000C)；
制备柱(安捷伦Zorbax，XDB-C18，21.2 mm×150 mm，5 μm)；
万分之一电子天平(上海越平科学仪器有限公司)；
摇床(上海智城分析仪器制造有限公司，ZWY-2102)；
柱层析用硅胶、薄层层析用硅胶GF254(青岛海洋化工厂有限公司)；
Sephadex LH-20(美国GE公司)；
RP-18(日本YMC产品，40～60 μm)；
D101大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；
色谱试剂(上海星可高纯度试剂公司)；
石油醚、二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂均为工业纯度经重蒸后使用。显色剂为H2SO4(10%)的乙醇液。

1.2 菌种与材料

菌株鉴定：自云南昆明东川铜矿中分离，16S rRNA基因序列分析结果表明KC 17012为链霉菌属(Streptomyces)菌株。大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)以及枯草芽孢杆菌(ATCC6051)，以上病原菌均购于上海药物研究所。菌种目前保存于昆明学院农学与生命科学学院菌种库(编号为KC 17012)。

菌株KC 17012活性培养基：PDA培养基(g/L)，土豆 200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，自来水1 000 mL，微量盐1 mL，121 ℃，灭菌30 min 。

菌株KC 17012发酵培养基：PDB 培养基(g/L)，土豆200 g，葡萄糖20 g，自来水1 000 mL，微量盐1 mL，121℃，灭菌 30 min。

指示菌培养基：LB 固体培养基(g/L)，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，琼脂20 g，自来水1 000 mL。

1.3 菌株活化与种子液的培养

将保存于4 ℃的菌株KC 17012Streptomycessp.接种于PDA平板，28 ℃培养7天以进行活化。然后将单菌落接种至改良ISP 2培养基(1 L)：酵母膏4 g，酵母浸粉5 g，葡萄糖4 g，动物蛋白胨2 g，植物蛋白胨1 g，微量盐1 mL，复合维生素少许，自来水1 000 mL，pH 7.2，恒温摇床28 ℃，180 r/min，发酵3天，作为种子液。

1.4 菌株发酵

将种子液接种至PDB培养基25 L(土豆200 g，葡萄糖20 g，自来水1 000 mL，微量盐1 mL，121 ℃，灭菌30 min)，200 mL/瓶，培养8天，28 ℃，180 r/min，发酵液采用纱布过滤，收集滤液，得发酵液25 L，然后将发酵液浓缩至2 L。

1.5 提取与分离

采用等体积的乙酸乙酯对发酵液进行萃取，共3次，浓缩萃取液，得乙酸乙酯浸膏43 g。将乙酸乙酯浸膏用甲醇溶解，过滤，除去不溶物，然后采用D101大孔树脂柱(直径80 mm×长度500 mm)初步分离，洗脱剂为10%→100%乙醇水梯度洗脱；
根据薄层色谱(TLC)，10%硫酸乙醇溶液显色合并相似成分，得6个组分Fr A～F。Fr A组分(1.3 g)，经Sephadex LH-20柱(MeOH)纯化，得到Fr A 1～3，Fr A-1组分(230 mg)经过多次硅胶柱层析除去杂质，然后结晶得到化合物2(120 mg),再次从母液中分离得到化合物3(72 mg)。Fr A-2 部分(137 mg)，采用多次硅胶柱色谱分离后得到化合物1(16 mg)。FrA-3 部分(70 mg)经过反复结晶得到纯品化合物4(55 mg)。Fr B组分(2.1 g)，采用Sephadex LH-20柱(MeOH)纯化，得Fr B1～4。组分Fr B1经RP-18反相柱色谱分离得Fr B1-1(80 mg)，采用制备液相分离纯化，以10%-100%色谱甲醇梯度洗脱(流速10 mL/min)得化合物5(19 mg，tR=11.43 min)和化合物6(21 mg，tR=13.23 min)。组分Fr B2(248 mg)采用硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脱，得到化合物7(18 mg)。Fr B3(120 mg)，采用硅胶柱(二氯甲烷：甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脱，得到化合物8(22 mg)。组分Fr B4(330 mg)通过多次结晶，得到纯度较高的化合物9(12 mg)。Fr C组分(3.1 g)，经Sephadex LH-20柱(MeOH)分离得到Fr C 1～3，Fr C-1组分(90 mg)采用硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇20∶1→5∶1，V/V)梯度洗脱，得到化合物10(11 mg)。Fr C-2 部分(430 mg)，采用硅胶柱色谱分离后得到组分Fr C-2-1(107 mg)，然后采用制备液相，以40%-80%色谱甲醇梯度洗脱(流速10 mL/min)得化合物11(3 mg)和化合物12(43 mg)。Fr C-3 部分(200 mg)采用硅胶柱色谱分离到纯品化合物13(57 mg)。Fr D组分(1.1 g)，采用Sephadex LH-20柱(MeOH)分离得Fr D1～3。组分Fr D1(100 mg)经RP-18反相柱色谱分离，得到样品Fr D1-1(37 mg)，采用硅胶柱色谱(二氯甲烷：甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脱得化合物14(1.8 mg)和化合物15(27 mg)。Fr D2(35 mg)采用硅胶柱(二氯甲烷：甲醇10∶1→5∶1，V/V)梯度洗脱，得到化合物16(3.8 mg)。组分Fr D3(49 mg)采用制备液相，得化合物17(7 mg)。组分Fr F(1.01 g)通过多次结晶，得到纯度较高的化合物18(200 mg)。

1.6 体外抗菌活性检测

本研究采用微量稀释法检测化合物的体外抑菌活性。分别将大肠杆菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)以及枯草芽孢杆菌(ATCC6051)接种于LB固体培养基，37 ℃培养24 h后，挑取单菌落2～3个于20 mL LB液体培养基中，37 ℃，180 r/min，摇床培养6 h，用LB液体培养基稀释成1×105CFU/mL菌悬液。称取适量的化合物1～18，用DMSO配制成100 μmol/L的储存液，并用0.22 μm微孔滤膜过滤。取无菌的96孔板，外周36孔分别加入100 μL无菌水，其余每孔加入100 μL 1×105CFU/mL菌悬液。同时，选取环丙沙星作为阳性对照，DMSO作空白对照，且每个梯度设3个复孔，微板观察法检测其最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。

本文对Streptomycessp.KC 17012的次生代谢产物进行研究，分离鉴定了18个化合物(见图1)，其中包括二肽类，吲哚衍生物类，脱落酸类似物等，我们对分离得到的化合物进行体外抑菌活性测试，结果表明化合物1和10具有较好地抑制枯草杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的活性。

图1 化合物1～18的结构式Fig.1 The chemical structures of compounds 1-18

2.1 结构鉴定

化合物5无色油状物；
分子式C11H12N2O2，ESI-MS：m/z205 [M+H]+；
1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：10.87(1H，br s，COOH)，7.55(1H，d，J= 7.8 Hz，H-4)，7.33(1H，d，J= 7.8 Hz，H-7)，7.18(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，7.05(1H，d，J= 7.8 Hz，H-6)，6.97(1H，t，J= 7.8 Hz，H-5)，3.41(1H，dd，J= 9.0，4.2 Hz，H-2′)，3.30(1H，dd，J= 15.0，4.2 Hz，H-1a′)，2.94(1H，dd，J= 15.0，9.0 Hz，H-1b′)；
13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：123.9(C-2)，109.8(C-3)，118.4(C-4)，120.9(C-6)，111.3(C-7)，136.3(C-8)，127.3(C-9)，27.3(C-1′)，54.8(C-2′)，170.3(C-3′)。以上数据与文献[10]报道一致，故鉴定化合物5为色氨酸。

化合物7无色油状物，易溶于甲醇；
分子式C9H7NO2，ESI-MS：m/z162 [M+H]+；
1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.96(1H，dd，J= 7.2，1.2 Hz，H-5)，7.85(1H，s，H-2)，7.33(1H，dd，J=7.2，1.2 Hz，H-8)，7.08(2H，m，H-67)；
13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：133.5(C-2)，127.7(C-3)，108.9(C-4)，123.7(C-5)，122.2(C-6)，122.5(C-7)，113.0(C-8)，138.4(C-9)，169.4(C-10)。以上数据与文献[12]报道一致，故鉴定化合物7为3-羧基吲哚。

化合物8无色油状物；
分子式C7H7NO2，ESI-MS：m/z138 [M+H]+；
1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.83(1H，dd，J= 7.8，1.8 Hz，H-5)，7.25(1H，td，J= 7.2，1.8 Hz，H-3)，6.72(1H，dd，J= 7.8，0.6 Hz，H-2)，6.58(1H，t，J= 7.2，1.2 Hz，H-4)。以上数据与文献[13]报道一致，故鉴定化合物8为邻氨基苯甲酸。

化合物15无色油状物；
分子式C13H20O3，ESI-MS：m/z247 [M+Na]+；
1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：5.78(1H，br s，H-4)，5.70(1H，dd，J= 16.4，4.8 Hz，H-8)，5.67(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，4.22(1H，m，H-9)，2.38(1H，d，J= 16.8 Hz，H-2a)，2.06(1H，d，J= 16.8 Hz，H-2b)，1.81(3H，d，J= 4.8，1.2 Hz，H-13)，1.14(3H，d，J= 6.4 Hz，H-10)，0.94(3H，s，H-12)，0.92(3H，s，H-11)；
13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：42.6(C-1)，50.8(C-2)，201.4(C-3)，127.3(C-4)，167.6(C-5)，80.0(C-6)，137.1(C-7)，130.1(C-8)，68.8(C-9)，24.6(C-10)，23.5(C-11)，24.0(C-12)，19.7(C-13)。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定化合物15为布卢门醇 A。

化合物16无色油状物，易溶于甲醇；
分子式C13H20O3，ESI-MS：m/z225 [M+H]+；
1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.02(1H，d，J= 15.6 Hz，H-7)，6.29(1H，d，J= 15.6 Hz，H-8)，3.91(1H，m，H-3)，2.39(1H，dd，J= 14.5，5.0 Hz，H-4β)，2.28(3H，s，H-10)，1.67(1H，m，H-4α)，1.64(1H，m，H-2α)，1.26(1H，m，H-2β)，1.20(6H，s，H-12，13)，0.98(3H，s，H-11)；
13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：35.1(C-1)，46.7(C-2)，64.3(C-3)，40.5(C-4)，67.2(C-5)，69.8(C-6)，142.4(C-7)，132.8(C-8)，197.3(C-9)，28.2(C-10)，25.5(C-11)，29.1(C-12)，19.7(C-13)。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定化合物16为3α-hydroxy-5α，6α-epoxy-7-megastigmen-9-one。

化合物17白色粉末；
分子式C20H22O7，ESI-MS：m/z377 [M+Na]+；
1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.99(1H，d，J= 1.2 Hz，H-2′)，6.86(1H，dd，J= 7.8，1.8 Hz，H-6′)，6.78(1H，dd，J= 7.8 Hz，H-5′)，6.62(1H，s，H-2)，6.59(1H，s，H-6)，5.51(1H，d，J= 6.0 Hz，H-7′)，3.84(1H，m，H-9a′)，3.84(4′-OCH3)，3.77(1H，dd，J= 11.4，7.8 Hz，H-9b′)，3.67(9-OCH3)，3.47(1H，m，H-8′)，2.82(2H，t，J= 7.8 Hz，H-7)，2.61(2H，t，J= 7.8 Hz，H-8)；
13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：135.4(C-1)，116.6(C-2)，130.1(C-3)，147.1(C-4)，142.3(C-5)，117.1(C-6)，31.8(C-7)，37.3(C-8)，175.5(C-9)，135.1(C-1′)，110.6(C-2′)，147.6(C-3′)，149.2(C-4′)，116.2(C-5′)，119.8(C-6′)，88.9(C-7′)，55.9(C-8′)，65.2(C-9′)，56.5(4′-OCH3)，52.2(9-OCH3)。以上数据与文献[21]报道一致，故鉴定化合物17为trogopterin A。

化合物18白色粉末；
1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.28(1H，d，J= 4.2 Hz，H-6)，3.45(1H，m，H-3)，1.18(3H，s，H-19)，0.86(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.76(6H，overlap，H-26，27)，0.61(3H，s，H-18)。采用TLC展开，10%硫酸乙醇显色为紫色化合物，并与标准品对照，确定该化合物18为β-谷甾醇；

2.2 体外抗菌活性检测结果

本实验采用的受试菌株为大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草杆菌(Bacillussubtilis)。采用微板观察法检测其MIC值，其中用环丙沙星作为阳性对照，化合物1和10有较好的抑菌活性，其MIC值分别为11和33 μmol/L(阳性对照环丙沙星MIC为2 μmol/L)。

链霉菌具有神奇的创造功能，其次生代谢产物多具有显著的生理活性[3]。本文对东川铜矿来源链霉菌KC17012发酵液进行分离，得到18个成分，主要为二肽类、吲哚生物碱衍生物、脱落酸类似物等。其中化合物1和10通过体外抗菌活性检测，其体外抑菌活性MIC为11 和33 μmol/L，其余化合物均没有活性。化合物1～4为二肽类成分，含量较大，而化合物3是由D-型脯氨酸和L-型酪氨酸构成，这种由D-型氨基酸参与的肽类物质的构成形式在自然界中存在较少。化合物11～14为脱落酸(ABA)类似物成分。ABA是一种重要的植物激素，在调节植物生长，抵抗极端外环境等方面具有重要作用。但是ABA生产成本较高，难以大规模工业化生产，因此利用微生物代谢产生ABA具有广阔的应用空间。本文研究链霉菌KC17012发酵液的次级代谢产物及单体成分的抗菌活性，为后期深入挖掘该化合物的其他抗菌活性及抗菌机制提供了科学参考。

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