白菜NAC基因家族全基因组鉴定及其应答春化反应的表达分析

陈国户,庞小可,李广,王浩,3,吴思文,温宏伟,尹倩,袁凌云,侯金锋,唐小燕,汪承刚*

(1.安徽农业大学园艺学院/安徽省园艺作物育种工程实验室,安徽 合肥 230036;2.安徽省皖江蔬菜产业技术研究院,安徽 马鞍山 238200;3.山东省济宁市鱼台县农业技术推广中心,山东 济宁 272300)

转录因子(transcription factor)是一类特异性蛋白质分子,可以与顺式作用元件(cis-element)发生特异性结合,或与其他蛋白相互作用调控目的基因的表达强度,在生命活动中起着重要的作用[1]。转录因子根据不同DNA结合域,可以将其分为NAC(NAM-ATAF1/2-CUC2)、AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-responsive element binding proteins)、HB(heparin-binding)、MYB(v-myb avian myeloblastosis viral)、MADS(MCML,AGAMOUS,DEFICIENS,SRF)和SBP(squamosa promoter binding protein)等多个家族[2]。其中,NAC基因家族广泛存在于各植物中,是植物中最大、最重要的转录因子之一,参与各种生物过程的调控[3]。自矮牵牛属中发现第1个NAC转录因子编码基因NAM后,NAC基因家族已在多种植物中被全基因组鉴定,例如拟南芥有117成员[4],烟草有152个[5],水稻有151个[6],棉花有145个[7],玉米有87个[8]。

NAC基因家族名称由NAM(矮牵牛无顶端分生组织)、ATAF1/2(拟南芥转录激活因子1/2)和CUC2(拟南芥杯状子叶)首字母组合而成[9]。NAC转录因子蛋白N端有1个保守结构域,该结构域由5个基序(A、B、C、D和E)组成,长度约160个氨基酸,侧翼含有α-螺旋和β-折叠结构;其中A、C和D基序高度保守,A可能与NAC蛋白形成二聚体有关,C和D基序存在核定位信号并参与DNA的结合;B与E亚结构变异较大,可能与NAC基因的功能多样性密切相关[10]。NAC转录因子蛋白C端结构域差异很大,具有转录激活或抑制活性,参与多种网络的调控[11]。

NAC转录因子是一种多功能蛋白质,在调节植物生长发育、次生代谢及胁迫反应中具有重要的生物学功能,如茎尖分生组织、侧根、胚胎、种子发育[12-14],叶片衰老[15],细胞周期调控[16],以及各种应激反应中激素信号途径[14]等。NAC转录因子还在调控花器官发育方面发挥作用。例如,拟南芥AIF(antherindehiscencefactor)在花期发育过程中异位表达,导致花药不裂,出现不育表型[17];NST1(NACsecondarywallthickeningpromotingfactor1)和NST2也调控花药开裂[18];棉花NAC转录因子GhFSN5在拟南芥中异源表达,导致拟南芥转基因植株产生较小的荚果以及严重的不育性[19];甘蔗ScNAC23基因在拟南芥中异位表达加速了转基因植株抽薹、开花和叶片衰老[20];麻黄CcNAC1基因的过表达加速了植物的生长,促进了早期开花,提高了植物的耐旱性[21]。

白菜(Brassicarapa)是十字花科芸薹属中最重要的蔬菜之一,在全球范围内广泛种植和消费[22]。近年来,研究人员对白菜转录因子家族进行了大量的研究[23-25],其中对白菜NAC基因家族在不同发育阶段、环境胁迫和激素处理下的表达也进行了研究[26]。但NAC转录因子在应答春化反应中的表达分析尚未有报道。本研究通过生物信息学分析方法对白菜NAC转录因子进行全基因组鉴定,并对其理化性质、染色体分布、顺式作用元件、系统进化树及共线性等进行分析,同时基于转录组数据及RT-qPCR分析其在白菜不同组织及应答春化反应的表达模式,旨在为深入探索NAC基因应答春化反应的分子机制奠定基础。

1.1 数据来源

拟南芥基因组数据(TAIR10)来源于TAIR数据库;白菜基因组数据(V1.5)来源于BRAD数据库;NAC结构域序列文件(PF02365)从Pfam网站下载。白菜不同组织(根、茎、叶、花、荚等)[27]及春化反应(JWW春化0、25、30、35、45、50 d;XBJ春化0、10、15、25、40、50 d;4004春化0、35 d)[28-29]RNA-Seq原始数据从NCBI GEO与SRA数据库下载。RNA-Seq原始数据经过Trimmomatics及FastQC质控后,利用Hisat2比对至白菜基因组(V1.5)序列,再利用Feature Counts进行有参照转录组定量;基因表达水平采用FPKM值进行计算,差异表达基因采用DESeq2软件包进行计算[25,30]。

1.2 白菜NAC基因家族成员的鉴定

利用HMMER 3.0软件,以PF02365为模型,对白菜基因组(V1.5)进行全基因组搜索;同时利用拟南芥NAC基因家族蛋白序列[4],采用BLASTp技术对白菜基因组进行全基因组同源搜索(top≤5,E<1e-5)。将共同获得的白菜NAC候选序列,在InterProScan(https://www.ebi.ac.uk/interpro/about/interproscan/)、Pfam(http://pfam.xfam.org/)、SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)、SwissProt(https://www.expasy.org/resources/uniprotkb-swiss-prot)以及NR(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)等数据库中逐一鉴定;鉴定后的NAC基因家族再与白菜BRAD数据库中NAC基因家族成员进行比较,对有疑问的基因采用ClustalW及MEGA 7.0软件构建系统发育树进行鉴定,最终确定白菜NAC基因家族成员。

1.3 白菜NAC基因染色体定位及理化性质分析

利用TBtools软件[31]提取白菜NAC基因家族各基因、蛋白序列以及注释等信息,并绘制染色体定位图谱。使用EXPASY在线工具(https://web.expasy.org/compute_pi/),对NAC家族蛋白的相对分子质量与等电点等信息进行分析。

1.4 白菜NAC基因的保守域和系统进化树分析

通过MEME在线工具(http://meme-suite.org/tools/meme),对白菜NAC转录因子蛋白序列的保守基序进行分析,再利用TBtools软件对白菜NAC转录因子基因结构及结构域进行可视化分析。参考宋蒙飞等[32]的方法,使用ClustalW工具将拟南芥与白菜NAC蛋白序列进行比对,并利用MEGA 7.0软件,采用邻接法以及泊松校正与成对删除法(Bootstrap=1 000)构建系统进化树。

1.5 白菜NAC基因的共线性分析

利用TBtools软件对白菜及拟南芥NAC基因家族的蛋白序列进行all-BLASTp-all分析(top≤5,E<1e-5),采用TBtools软件中MCScanX工具提取共线性基因对,再利用Circos工具进行可视化。

1.6 白菜NAC基因家族组织表达及其应答春化反应分析

利用白菜不同组织转录组数据[27],分析白菜NAC基因家族的组织表达特征;利用白菜春化反应材料转录组数据[28-29],分析白菜NAC基因家族应答春化反应关键基因。对NAC基因家族春化反应关键基因,利用荧光定量PCR技术分析其在JWW和XBJ不同春化时间(JWW春化0、25、30、35、45、50 d;XBJ春化0、10、15、25、40、50 d)的相对表达量[28]。

2.1 白菜NAC基因家族的鉴定与理化性质分析

通过HMMER与BLASTp搜索,对白菜NAC基因家族进行全基因组鉴定,经过严格筛选,共获得188个NAC基因家族成员,对其序列进行了理化性质分析。白菜NAC基因家族碱基与氨基酸长度、相对分子质量与等电点等变异较大,NAC基因开放阅读框(ORF)长度最长为3 522 bp(Bra012470),最短为375 bp(Bra010895),氨基酸长度为124～1 173,相对分子质量为(14.43～128.20)×103,等电点(pI)为4.43～9.88(图1),表明它们可能在不同的微细胞环境中发挥着不同的作用。对其等电点与相对分子质量之间关系进行分析,发现白菜NAC基因家族蛋白相对分子质量主要集中在(20～60)×103,且酸性蛋白数量远大于碱性蛋白数量(图1)。

图1 白菜NAC基因家族蛋白等电点与相对分子质量分析Fig.1 Putative isoelectric points(pI)and relative molecular weights of NAC gene family proteins in Brassica rapa

2.2 白菜NAC基因家族染色体分布

如图2所示:白菜NAC基因家族188个成员不均等分布在10条染色体上。其中,A04号染色体上分布的NAC基因数量最少,只有5个成员(2.66%);A03号染色体上分布的NAC基因数量最多,有29个成员(15.4%),说明各染色体上的NAC基因数量与染色体大小无关。此外,白菜NAC基因家族中未发现基因串联重复现象。

图2 白菜NAC基因家族的染色体定位Fig.2 Chromosomal mapping of NAC family genes in B.rapa

2.3 白菜NAC基因结构与保守域分析

基于白菜NAC基因家族的系统发育关系,对白菜NAC基因家族成员的内含子/外显子分布及保守基序进行分析,发现白菜NAC基因家族成员的基因结构及保守基序差异较小,并且基因结构和保守基序决定了其亲缘关系的远近(图3)。基因结构分析表明,白菜NAC基因家族成员含有0～16个数量不等的内含子;其中,4个成员(Bra004575、Bra004579、Bra033405、Bra036034)不含内含子,1个成员(Bra012470)含有16个内含子,其余大部分成员仅含有2～6个内含子,并且聚集在一起的NAC基因具有相似的结构。保守基序分析表明,白菜NAC基因家族成员基序结构与分布高度相似,N端结构域非常保守,绝大部分成员N端均含有motif 2、motif 3、motif 4、motif 5(NAC基因家族的基本特征),说明这些基序是NAC蛋白功能所必需的。

图3 白菜NAC基因家族保守基序及基因结构分析Fig.3 Conserved motif and gene structure analysis of NAC gene family in B.rapa

2.4 白菜NAC基因的系统发育分析

对白菜和拟南芥NAC家族成员蛋白的氨基酸序列进行系统进化树分析,结果(图4)表明,188个BrNAC与AtNAC成员共分成7个亚簇,其中A亚簇成员数量最多,含有66个BrNAC与35个AtNAC成员;B亚簇含有41个BrNAC与18个AtNAC成员;C亚簇含有7个BrNAC与8个AtNAC成员;D亚簇含有 47个BrNAC与20个AtNAC成员;E亚簇含有20个BrNAC与8个AtNAC成员;F亚簇含有5个BrNAC与3个AtNAC成员;G亚簇成员数量最少,仅含有2个BrNAC与2个AtNAC成员。各簇中BrNAC与AtNAC成员数量比值为1∶1～2.5∶1,表明白菜和拟南芥具有较近的亲缘关系,且两者之间存在着一些关系密切的同源NAC基因。

图4 白菜与拟南芥NAC基因家族系统进化树分析Fig.4 Phylogenetic tree of NAC gene family from B.rapa and Arabidopsis thaliana

2.5 白菜NAC家族基因共线性分析

由图5可见:白菜NAC基因家族188个成员中,共有155对旁系同源基因对,其中89对存在着单个基因对应多个基因的情况(1∶1～1∶4),表明白菜NAC家族在发育进化过程中发生了大量的基因复制现象。白菜与拟南芥NAC基因家族之间,同样存在着大量的直系同源基因对,160个BrNAC基因与88个AtNAC基因组成228个共线性基因对(图6),表明这些基因对可能来自同一祖先。

2.6 白菜NAC家族基因表达模式及响应春化反应分析

如图7所示:白菜NAC基因家族188个成员中,大部分成员在白菜不同组织中有转录表达(图7-A);对各组织FPKM>10的BrNAC基因进行分析,发现仅有13个BrNAC成员在各组织中有较高的表达丰度(图7-B),表明这些基因可能在白菜整个生长发育阶段发挥着重要的作用。此外,在高转录丰度成员中,有21个成员在花与荚中特异表达,有6个成员在根中特异表达,表明这些特异表达BrNAC基因具有较强的组织表达特异性,可能对促进特定组织的发育起着重要的作用。

图5 白菜NAC基因对复制事件分析Fig.5 Analysis of duplicated NAC gene pairs in B.rapa

图6 拟南芥(Chr1—Chr5)与白菜(A01—A10)NAC基因家族的共线性分析Fig.6 Synteny analysis of NAC gene family between A.thaliana(Chr1-Chr5)and B.rapa(A01-A10)

图7 白菜NAC家族基因的组织表达模式分析[log2(FPKM)](A)及各组织中 高表达基因(FPKM>10)韦恩图分析(B)Fig.7 Expression analysis of NAC genes in different tissues based on RNA-Seq[log2(FPKM)](A) and Venn analysis of high-expression genes(FPKM>10)in different tissues(B)

利用白菜春化反应转录组数据分析BrNAC差异表达基因,结果(图8)表明,在白菜JWW、XBJ与4004材料春化转录组数据中,差异表达BrNAC基因共有64个,其中共有28个基因至少在2个材料中差异表达,说明这些BrNAC基因可能与春化反应相关。在28个应答春化反应差异表达基因中,6个BrNAC基因下调表达,22个BrNAC基因上调表达。

图8 白菜NAC基因家族应答春化反应分析Fig.8 Analysis of NAC gene family responsed to vernalization in B.rapa A. 白菜NAC基因应答春化反应DEG表达分析;B. 白菜材料 JWW、XBJ和4004中NAC基因应答春化反应DEG韦恩图分析。A. Expression analysis of BrNAC genes responsed to vernalization;B. Venn analysis of BrNAC genes responsed to vernalization among Chinese cabbage materials JWW,XBJ and 4004.

对JWW与XBJ材料中差异表达基因,分别进行表达趋势分析,结果如图9所示。JWW与XBJ这2个材料有相同的显著富集的趋势(P<0.05)。白菜NAC基因家族成员表达丰度,随春化时间的延长,2个材料共有16个基因逐渐上调表达(趋势7),分别有14个基因在春化25 d(JWW)及22个基因在春化10 d(XBJ)时丰度达到最大(趋势6)。此外,在显著富集趋势中,JWW与XBJ两个材料共同有BrNAC基因 12个,其中5个BrNAC基因与春化密切相关,表明这些基因为白菜NAC家族应答春化关键基因。

图9 白菜JWW和XBJ NAC基因应答春化反应DEG表达趋势(A、B)及韦恩图(C)分析Fig.9 DEG expression profiles(A,B)and Venn analysis(C)in Chinese cabbage JWW and XBJ

利用荧光定量PCR技术,进一步分析白菜NAC基因家族应答春化反应关键基因及春化途径基因BrFLC1的表达水平,结果如图10所示。Bra004385、Bra004736、Bra031950、Bra033296、Bra036327基因经过低温春化后,其在JWW和XBJ中的相对表达量均显著上升,其中4个BrNAC基因(Bra004385、Bra004736、Bra031950、Bra036327)的表达量在春化过程中维持较高水平;而Bra033296的表达量,JWW在春化30 d时达到最高,随后逐渐降低,但仍高于春化初始时期的表达量,XBJ在春化10 d时达到最高,随后随着春化时间表达量先降低后升高,再降低,最后再升高;而春化途径BrFLC1基因随春化时间延迟,其表达水平急剧下降后,缓慢上升然后再下降。

图10 白菜NAC基因应答春化反应关键基因及FLC基因的表达分析Fig.10 Expression analysis of the key NAC and FLC genes related to vernalization in B.rapa

植物特异性NAC转录因子(TF)是植物中最大的转录调节因子家族之一,在植物的生长发育调控和逆境反应中发挥着重要作用[3]。目前,多个物种的NAC基因家族已被鉴定出来[4-8],但对白菜NAC基因家族应答春化反应知之甚少。本研究中,利用同源比对及HMMER搜索,结合多重数据库严格筛选,共鉴定出188个BrNAC转录因子成员,是拟南芥NAC基因家族数量的1.5倍,但显著少于Liu等[26]的报道,其最主要原因为他们对白菜全基因组进行HMMER筛选时采用了较低的筛选参数(E<1e-3),并且未进行多个数据库的筛选鉴定。

在多基因家族进化过程中,基因结构普遍存在多样性,有利于基因进化选择新功能,以适应环境变化[33]。本研究对白菜NAC基因家族成员基本特征进行分析,其家族全部成员蛋白序列N端均含有NAM结构域、基因结构多样,但同一聚类亚组中的NAC成员具有相似的功能基序、外显子/内含子结构和位置,表明这些成员关系密切,可能具有相似的功能,这与Liu等[26]的研究一致。此外,同一亚组中的成员之间也存在序列大小、外显子的相对位置和数量等差异,这可能是白菜NAC基因家族在进化过程中发生了基因片段的剪接和插入所致,从而获得了新的基因功能[34]。

白菜在进化过程中经历过2次全基因组复制及1次全基因组三倍化事件[35]。本研究对白菜与拟南芥NAC成员进行系统进化树分析,7个亚簇中BrNAC与AtNAC成员数量比值为1∶1～2.5∶1,表明白菜与拟南芥之间在进化中存在着密切相关的同源NAC基因。白菜与拟南芥NAC基因家族成员之间存在大量的直系同源基因对,表明白菜NAC基因家族大部分成员与拟南芥NAC基因成员可能来自同一祖先,且白菜NAC基因家族的扩张主要来源于基因复制事件[33]。

大部分BrNAC基因具有组织表达特异性,仅少数BrNAC转录因子在白菜各组织中有较高的表达丰度,表明它们可能在白菜的生长发育中起重要作用。本研究中进一步利用春化转录组数据[28-29]分析白菜NAC基因家族应答春化反应关键基因,结果共有6个BrNAC成员在JWW、XBJ及4004材料春化前、后均显著差异表达,表明这些基因与春化反应密切相关。对JWW与XBJ材料中差异显著的BrNAC基因进行表达趋势分析,显示显著表达趋势中共有40个BrNAC基因;其中5个BrNAC成员为上述显著差异表达基因一致,进一步表明这些BrNAC成员与春化反应密切相关。对这5个BrNAC成员在不同春化时期的表达水平进行分析,显示其相对表达量均显著上升,并且在春化50 d时仍维持着较高的表达量;此外,上述 5个白菜NAC基因的表达趋势与春化关键基因FLC的表达趋势相反,特别是与Bra036327基因完全相反,表明该NAC基因为白菜春化应答基因,在白菜春化过程中可能具有重要的作用。

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