马铃薯StPEBP基因家族成员鉴定及其在块茎中的表达分析

张文哲，荐红举,2，尚丽娜，张梅花，王季春,2，Ahmed Mahmoud，吕典秋,2*

（1.西南大学农学与生物科技学院，重庆 400715；
2.薯类生物学与遗传育种重庆市重点实验室，重庆 400715；
3.Department of Vegetable Crops,Faculty of Agriculture,Cairo University,Giza 12613,Egypt）

马铃薯是全球第四大粮食作物，种植面积仅次于小麦、水稻和玉米，在食品和工业中具有重要用途[1]。马铃薯作为主粮，其块茎中富含淀粉、维生素、矿质元素和纤维素，且脂肪类物质少，提高马铃薯产量和质量可保障国家粮食安全。但马铃薯产量和品质易受环境因素影响，因此，鉴定马铃薯块茎形成相关基因对于解析马铃薯块茎形成机制进而提高马铃薯产量和品质至关重要。

磷脂酰乙醇胺结合蛋白（Phosphatidylethanolaminebinding protein，PEBP）基因家族广泛存在于细菌、酵母、真菌和动植物中。在植物中，PEBP 基因家族根据功能主要分为3个亚家族：FT（FLOWERING LOCUS T）、TFL1（TERMINAL FLOWER 1）和MFT（MOTHER OF FT AND TFL1），MFT 亚家族是FT亚家族和TFL1 亚家族的祖先，最先被挖掘出，随后鉴定出具有功能的FT 和TFL1 亚家族[2]。MFTlike 亚家族主要在种子的萌发中发挥重要作用[3]。在拟南芥中，FT-like 亚家族和TFL1-like 亚家族具有高度的氨基酸序列同源性，他们都在开花过程中发挥调节作用[2]，FT-like 亚家族通过调节温度和光周期促进花的形成并控制生殖生长阶段的开始，而TFL1-like 亚家族则抑制花的形成[4]。同时，TFL1-like 亚家族通过维持顶端分生组织和花序分生组织的不确定性来控制营养生长和生殖生长阶段的持续时间[2,5]。马铃薯块茎形成与拟南芥开花过程共享相同或相似的调节分子和通路[6-8]。在拟南芥中，FT 蛋白作为成花素，可以从叶片运输到顶端分生组织，并促进花器官的形成[9-11]，在植物成花诱导过程中发挥重要调控作用。马铃薯StPEBP家族基因中SELF-PRUNING 6A（StSP6A）和StSP5G已被鉴定为拟南芥FT 蛋白的同源基因，并参与马铃薯块茎的形成过程[12]。随着马铃薯中FT 蛋白功能的深入研究，发现马铃薯开花调节机制和短日照条件促进马铃薯块茎形成机制是由2种不同的FT类型同源基因（StSP5G和StSP6A）控制[6,13]。StSP5G和StSP6A作为块茎形成的信号，其在马铃薯块茎形成过程中发挥重要作用，StSP5G是块茎形成的负调节因子，而StSP6A是块茎形成的正调节因子[14-16]。

已在多个物种中鉴定出PEBP 基因家族成员，如拟南芥、陆地棉、甘蓝型油菜等[17-21]，目前马铃薯中StPEBP基因家族成员虽被鉴定[22]，但该家族基因在结薯中的功能分析尚未深入研究。本研究将拟南芥PEBP 基因家族的蛋白序列与马铃薯全基因组的蛋白序列通过Blastp 方式以及保守结构域鉴定，获得马铃薯StPEBP基因家族基因，并对其motif 序列、基因结构以及启动子元件进行预测和分析，深入挖掘除StSP5G和StSP6A外在马铃薯块茎诱导中发挥功能的基因，为马铃薯结薯基因的筛选提供理论参考。

1.1 序列的获得

从Ensembl Plants 数据库（https:∕∕plants.ensembl.org∕）中获取拟南芥以及马铃薯的全基因组蛋白序列，在拟南芥全基因组蛋白序列中筛选出PEBP基因家族的蛋白序列。将拟南芥PEBP 基因家族的蛋白序列与马铃薯的全基因组蛋白序列在NCBI数 据 库（https:∕∕www.ncbi.nlm.nih.gov∕）中 进 行Blastp，阈值E＜10-5，初步筛选拟南芥PEBP 基因家族在马铃薯中的同源基因。将初步鉴定的基因输入Pfam 数据库（https:∕∕pfam.xfam.org∕）再次进行筛选（Pfam 号：PF01161），最终确定马铃薯中StPEBP基因家族的基因，同时提取马铃薯中StPEBP基因家族的蛋白序列和CDS序列。

1.2 序列比对及进化分析

利用MEGA 7.0 软件对获取的拟南芥、马铃薯、番茄、烟草和辣椒基因组内的PEBP 基因家族的序列进行多重序列比对，番茄、烟草和辣椒的PEBP 基因家族的序列均是比对拟南芥PEBP 基因家族的蛋白序列鉴定得出。随后使用邻接法（Neighbor joining，NJ）构建基因分子进化树，参数均为默认，并利用iTOL（https:∕∕itol.embl.de∕）对进化树进行优化。

1.3 马铃薯StPEBP 基因结构和motif预测

根据获得的马铃薯StPEBP基因家族的基因组DNA 和CDS 序 列，使 用 线 上 工 具GSDS（http:∕∕gsds.cbi.pku.edu.cn∕）对其基因结构进行分析。利用 在 线 工 具MEME（http:∕∕meme-suite.org∕）对 马铃薯StPEBP基因家族蛋白序列的motif 进行预测，motif 数量设置为10 个，其余参数为默认。利用TBtools v1.09 软件对基因结构和motif 分析并作图。

1.4 顺式作用元件预测

使用TBtools 软件提取马铃薯StPEBP基因的CDS 序列上游2 000 bp 的启动子序列，提交到PlantCare 网 站（http:∕∕bioinformatics.psb.ugent.be∕webtools∕plantcare∕html∕）进 行 顺 式 作 用 元 件 预测。将预测的顺式作用元件位点、类型以及长度放入TBtools v1.09进行可视化。

1.5 染色体定位与共线性分析

在马铃薯全基因组注释文件中获得StPEBP家族基因的起始位点和终止位点，使用TBtools v1.09 软件展示StPEBP家族基因在染色体上的位置。使用TBtools 软件对马铃薯StPEBP基因家族成员与番茄和辣椒的PEBP 基因家族成员进行共线性分析。利用TBtools 软件对几个物种进行全基因组比对，得到马铃薯与几个物种基因之间的对应关系。对所得到的基因信息、起始位点和终止位点等进行整理归纳，进而用于进一步可视化分析。

1.6 选择压力分析

使用TBtools v1.09 软件进行比对得到马铃薯基因对信息，利用马铃薯StPEBP家族基因对信息、CDS 序列、蛋白序列进一步计算出非同义替换率（Non-synonymous substitution rate，Ka）和同义替换率（Synonymous substitution rate，Ks）。

1.7 马铃薯StPEBP 家族成员的表达分析

利用Potato Genomics Resource 数据库[http:∕∕Spud DB（uga.edu）]中下载的马铃薯DM 1-3 516 R44（DM）材料的不同发育时期以及不同处理的转录组数据，分析StPEBP基因家族的表达情况。并利用在线工具Heatmapper（http:∕∕www2.heatmapper.ca∕）绘制热图。

1.8 匍匐茎不同发育时期的基因表达变化

以马铃薯品种‘Desiree’为试验材料，取弯钩角度为30°、60°、90°、120°、150°的匍匐茎和不同发育时期的块茎。采样后进行RNA 提取和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析。采集的样本在提取RNA之前立即冷冻在液氮中，并保存在-80℃超低温冰箱。每个样品进行3次生物学重复。RNA提取使用生工生物工程（上海）股份有限公司EZ-10 DNAaway RNA Mini-Preps Kit 试剂盒，具体操作步骤参考试剂盒说明书。使用Taq Universal SYBR Green Supermix 试剂盒进行定量，以StEf1a为内参基因。反应体系为10 μL：1 μL cDNA，上、下游引物各0.2 μL，SYBR（BioRad）5 μL，ddH2O补齐至10 μL。qRT-PCR 程序为：95℃预变性30 s，95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，34个循环，重复3 次。根据2-ΔΔCt法得到StPEBP的相对表达量，使用Graphpad Prism 8 绘制表达图。qRT-PCR 所用引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列信息Table 1 Primers used for qRT-PCR

2.1 马铃薯StPEBP 家族基因成员鉴定

利用6 个拟南芥中PEBP 家族基因的蛋白序列比对，最终在马铃薯基因组中鉴定出10 个StPEBP家族基因（表2），均具有保守结构域（InterPro:IPR00891）。StPEBP家族基因蛋白的分子量最大值为20.01 kDa（StPEBP9），最小值为9.27 kDa（StPEBP1）；
等电点分布在5.21（StPEBP4）～9.07（StPEBP3）；
亲水性最大值为-0.08（StPEBP7），最小值为-0.47（StPEBP2）。亚细胞定位预测结果表明，StPEBP家族基因编码蛋白定位在细胞质中。

表2 马铃薯StPEBP基因家族鉴定与分子特征分析Table 2 Genome-wide identification and molecular characterization of StPEBP gene family in potato

2.2 序列比对与进化树构建

利用MEGA 7.0软件将5个物种（拟南芥、番茄、辣椒、烟草和马铃薯）PEBP基因家族蛋白序列进行多序列比对，并通过邻接法构建进化树（图1），该家族基因可分为4个亚家族，第一亚家族为PEBPlike 亚家族（StPEBP1），第二亚家族为MFT-like亚家族（StPEBP7），第三亚家族为FT-like 亚家族包括FT（StSP6A）和TSF（StSP3D和StSP5G），第四亚家族为TFL-like 亚家族包括ATC（StPEBP2）、BFT（StPEBP3、StPEBP4和StPBEP5）和TFL（StPEBP10）。StSP6A（StPEBP6）属于FT-like 亚家族中的FT 小亚家族，StSP5G（StPEBP9）属于FT-like 亚家族TSF 小亚家族。TFL-like 亚家族是马铃薯StPEBP家族中基因数量最多的亚家族，有5 个 成 员，PEBP-like 亚 家 族 和MFT-like 亚 家 族是StPEBP基因家族中基因数量最少的亚家族，均仅有1 个成员。同时分析了马铃薯与其他物种PBEP 基因家族进化关系，可见马铃薯PBEP 基因家族与茄科植物番茄在进化过程中亲缘关系更为接近。

图1 马铃薯、番茄、烟草、辣椒和拟南芥PEBP基因家族进化分析Figure 1 Relationship analysis of PEBP gene family in potato,tomato,tobacco,pepper and Arabidopsis thaliana

2.3 基因结构、motif以及domain预测

根据已鉴定的马铃薯StPEBP基因家族成员的蛋白序列和全基因组的注释序列，对基因结构进行分析。除StPEBP1（PEBP-like）和StPEBP4（TFL1-like）包含2 个外显子和1 个内含子，家族其他成员均包含4 个外显子和3 个内含子（图2）。结构域分析结果表明，鉴定出的10 个StPEBP基因均具有PEBP superfamily 保守结构域，证实他们均为StPEBP基因家族成员。motif 序列分析，除StPEBP4外所有基因均具有特征性的保守motif序列motif 5。除StPEBP1和StPEBP4外，其余所有基因均具有保守的基序motif 1、motif 2 和motif 3；
除StPEBP1，StPEBP2和StPEBP4外，余下基因均具有保守的基序motif 1、motif 2、motif 3、motif 4和motif 5。StPEBP1属 于PEBP-like 亚 家 族，StPEBP2和StPEBP4均属于TFL1-like 亚家族，其在进化过程中不仅基因结构发生变异，基因序列也发生变异。由结果分析可知，除PEBP-like亚家族和TFL1-like 亚家族外，StPEBP家族基因中其他亚家族的基因序列功能较为保守。

图2 马铃薯StPEBP基因家族进化树、motif序列与基因结构Figure 2 Phylogenetic tree,motif sequence and gene structure of StPEBP gene family in potato

2.4 顺式作用元件预测分析

使用PlareCare 对10 个StPEBP家族基因起始密码子上游的2 000 bp 进行顺式作用元件预测，并用TBtools 进行展示。结果表明，StPEBP家族基因启动子区域与光响应相关的元件最多。同时，在StPEBP基因家族的启动子中存在许多激素响应元件，如水杨酸响应元件、茉莉酸响应元件、生长素响应元件和脱落酸响应元件，其也可能在调控块茎形成中发挥重要作用。StPEBP家族基因启动子中也含有许多低温响应元件、防御元件和应激反应元件，表明StPEBP家族基因可能在应激反应防御中发挥作用（图3）。

图3 马铃薯StPEBP基因家族顺式作用元件预测Figure 3 Prediction of cis-acting elements of StPEBP gene family in potato

2.5 选择压力分析

以拟南芥PEBP 基因家族为对照估算马铃薯StPEBP基因家族在进化过程中的选择压力（表3）。马铃薯StPEBP基因家族的所有基因Ka∕Ks 均小于1，受到纯化选择，马铃薯中StPEBP基因家族较拟南芥PEBP基因家族发生了进化。

表3 马铃薯和拟南芥PEBP选择压力分析Table 3 Selective pressure analysis of PEBP in potato and Arabidopsis thaliana

2.6 染色体定位分析及共线性分析

为了进一步分析其基因复制情况，首先对StPEBP基因家族进行染色体定位分析（图4），StPEBP基因家族在染色体上分布并不均匀，仅分布在1、3、5、6、9 和11 号染色体上，1、3、9、11 号染色体上含有2 个StPEBP基因，5、6 号染色体上各含有1 个StPEBP基因。此外，进一步分析了马铃薯基因组内StPEBP基因家族的复制情况（图4A），马铃薯与茄科植物番茄和辣椒之间的PEBP基因的共线性情况（图4B，图4C）。马铃薯基因组内存在两对重复基因，即StSP6A和StSP3D、StPEBP2和StPEBP4。将马铃薯分别与茄科植物番茄和辣椒之间PEBP 家族基因进行共线性分析，发现番茄和马铃薯间存在11 对共线性基因（图4B，表4），辣椒和马铃薯之间存在8 对共线性基因（图4C，表4）。结果表明，马铃薯StPEBP家族与番茄PEBP 家族共线性较马铃薯StPEBP家族与辣椒PEBP家族同源性高，并且在进化过程中更为保守。

表4 马铃薯StPEBP和番茄及辣椒共线性基因Table 4 Synteny analysis of StPEBP gene family in potato,tomato and pepper

图4 马铃薯PEBP基因家族共线性分析Figure 4 Synteny analysis of PEBP gene family in potato

2.7 StPEBP 基因家族成员的组织表达分析

在Potato Genomics Resource 数据库中StPEBP基因家族组织表达的转录组数据表明，7 个StPEBP家族基因在马铃薯的15 个组织中均呈现出高表达水平，而一些基因在1 或2个组织中表达较低（图5）。例如，StPEBP3在叶片和愈伤组织中分别表现出低表达水平，而StSP3D（StPEBP8）在叶柄中表现出低表达水平，StSP5G（StPEBP9）在果实内部表现出低表达水平。但是大部分基因在马铃薯的各个组织中均高表达，因此，推断StPEBPs基因家族也可能参与马铃薯植株的发育。

图5 StPEBP基因家族在马铃薯不同组织中的表达分析Figure 5 Expression analysis of StPEBP gene family in different tissues of potato

为了进一步研究StPEBP家族基因在马铃薯不同组织中的表达模式，进行了qRT-PCR。StPEBP1在小薯中表达水平最高，其次茎尖、根和大薯中表达水平较高，在其他组织中表达水平较低。StPEBP2仅在根和茎尖表达水平较高，在其他组织中表达水平较低。StPEBP3在小薯中表达水平最高，在花蕾和茎中表达水平较高，其次是大薯，在其他组织中表达水平较低。StPEBP4在花蕾中表达水平最高，其次是叶片，在其他组织部位表达水平较低。StPEBP5和StPEBP7在花蕾中表达水平最高，其次是茎，在其他组织中表达水平相似且较低。StSP3D（StPEBP8）在茎中表达水平最高，其次是叶片，在茎尖、花蕾和匍匐茎表达量相似且较高，在其他组织部位的表达水平较低（图6）。

图6 马铃薯StPEBP基因家族在不同组织中的表达模式Figure 6 Expression patterns of StPEBP gene family in different tissues of potato

2.8 StPEBP 基因家族在块茎发育中的表达分析

为了探索StPEBP 基因家族在块茎发育过程中的作用，使用qRT-PCR 检测其在不同发育阶段的匍匐茎和块茎中的表达水平（图7）。随着匍匐茎弯钩角度从60°到120°变化StPEBP1 表达量增加，在匍匐茎弯钩角度为150°时StPEBP1 表达量急剧下降，但其在小薯中表达量很高，大薯中表达量极低。StPEBP2随着匍匐茎弯钩角度从60°到120°变化表达量增加，匍匐茎弯钩角度达到150°后StPEBP2表达量下降并保持稳定。StPEBP3在大薯中表达量最高，其次在弯钩角度为150°的匍匐茎和小薯中表达量较高，在匍匐茎发育的其他阶段表达量极低。StPEBP5在小薯中表达量最高，在匍匐茎其他发育阶段表达量极低。在弯钩角度为150°的匍匐茎中，StSP6A（StPEBP6）的表达量明显增加，小薯和大薯中StSP6A的表达量也较高，在其他时期表达量较低。StPEBP7在匍匐茎弯钩角度为120°时表达量最高，在大薯中的表达量类似于匍匐茎弯钩角度为150°时的表达量，低于匍匐茎弯钩角度为120°时表达量。StSP3D（StPEBP8）在匍匐茎弯钩角度为30°时表达量最高，其次在匍匐茎弯钩角度为90°和小薯中表达量较高，其他时期表达量较低。StSP5G（StPEBP9）在匍匐茎弯钩角度为120°时表达量最高，在匍匐茎弯钩角度为30°和90°时表达量较高，其他时期表达量较低。StPEBP10在匍匐茎弯钩角度为60°时表达量最高，在匍匐茎弯钩角度为90°时和大薯中表达量较高。

图7 马铃薯StPEBP基因家族在匍匐茎发育过程中的表达模式Figure 7 Expression pattern of potato StPEBP gene family during stolon development in potato

PEBP 基因家族不仅在开花调节通路中发挥重要作用，还参与了植物种子萌发和非生物胁迫响应等调控过程[23]。在马铃薯中，StPEBP基因家族成员StSP5G、StSP6A和StSP3D已鉴定与马铃薯块茎诱导及开花有关，但其他成员在块茎形成中的作用依然未知。因此本试验在鉴定马铃薯DM v3.4 版本中StPEBP家族基因具有10 个成员后，并分析了其在块茎发育中可能发挥的功能。同时，进行了StPEBP基因家族的保守基序、基因和蛋白结构、顺式作用元件、染色体定位、共线性关系及组织表达分析。

系统发育分析揭示了马铃薯中StPEBP家族基因与拟南芥中PEBP 家族基因亚家族分类并不一致，拟南芥中PEBP 家族基因分为3 个亚家族，分别是TFL1-like、MFT-like 和FT-like[24]，而马铃薯中StPEBP家族基因分为4 个亚家族，分别是TFL1-like、MFT-like、FT-like 和PEBP-like。通过系统发育分析结果表明，PEBP-like 亚家族与StPEBP家族基因其他亚家族亲缘关系较远。并且在马铃薯中，只有StPEBP1属于PEBP-like 亚家族，该亚家族并未在拟南芥、苹果和水稻中发现，但在茄科植物烟草、辣椒和番茄中各鉴定出1 个PEBP-like 亚家组基因，推测PEBP-like 亚家组应该是在进化过程中茄科植物所特有的亚家族，可能具有一定功能，今后进行深入探究。此前，有报道称MFT-like 亚家族是FT-like 亚家族和TFL1-like 亚家族的祖先。在苔藓植物和石松属植物中，没有FT-like 亚家族和TFL1-like 亚家族同源基因，但分别有4 和2 个MFT-like 亚家族同源基因，表明FT-like 亚家族和TFL1-like 亚家族基因是随种子植物的进化而出现的[3]，因此推测马铃薯中FT-like 亚家族和TFL1-like 亚家族基因也是在进化过程中而出现的。在马铃薯和番茄中，已经报道具有影响马铃薯结薯和番茄果实成熟功能的基因均属于FT-like 亚家族[6]，由此猜测PEBP 基因家族中FT-like 亚家族基因是影响茄科植物果实成熟和开花时间的重要基因，对于茄科植物果实发育具有重要的研究价值。

通过对马铃薯StPEBP家族基因的motif 分析，发现10 个StPEBP家族基因除StPEBP4外均具有保守的基序motif 5，这说明motif 5 是马铃薯StPEBP基因家族中最保守的序列，也可能是StPEBP家族基因发挥其生物学功能的基序。同时，分析了4 个亚家族的基序保守性，大部分StPEBP家族基因均具有motif 1～5，FT-like 亚家族和MFT1-like 亚家族基序是保守的，均具有motif 1～5，而PEBP-like亚家族和TFL1-like亚家族基序发生变化，StPEBP1（PEBP-like）仅有motif 5，StPEBP2（TFL1- like）缺 少motif 4，StPEBP4（TFL1-like）却仅有motif 3 和motif 4。在本试验中，PEBP-like 亚家族基因（StPEBP1）和TFL1 亚家族基因（StPEBP4）的内含子和外显子数量也发生了变化，推测可能是在进化过程中PEBP-like亚家族和TFL1-like 亚家族发生变异，而其他亚家族结构在进化过程中非常保守。

共线性分析结果显示StSP6A（StPEBP6）和StSP3D（StPEBP8）是重复基因，序列比对发现StSP6A和StSP3D氨基酸序列一致性高达70%。已有文献报道[25,26]，FT-like 亚家族和TFL1-like亚家族在植物中功能相反，主要是由于含有LGRQTVYAPGWRQN的氨基酸片段和三联体LYN的关系，同时FT-like亚家族含有LGRQTVYAPGWRQN氨基酸片段在植物中是保守的并具有功能的。序列比对中同样发现马铃薯StSP6A中具有LGRQTVYAPGWRQN 氨基酸片段中的一部分TVYAPGWRQN 片 段，StSP3D具 有TVYAPNWRQN片段，与StSP6A中TVYAPGWRQN 片段相比，仅有一个氨基酸序列改变，G 改变为N，在马铃薯StSP6A和StSP3D中已被鉴定与马铃薯结薯和开花有关，因此推断StPEBP家族中具有LGRQTVYAPGWRQN 氨基酸片段的基因，对于研究马铃薯结薯和开花意义较大。

通过表达模式分析发现，当匍匐茎弯钩角度为150°时，StSP6A（StPEBP6）的表达量急剧增加，在小薯和大薯中表达量也较高。这再次证实了StSP6A在块茎形成过程中发挥了重要的作用。除StPEBP6外，StPEBP1随着匍匐茎发育表达量增加，并且在小薯中高表达，StPEBP3和StPEBP5表达量也在块茎中高表达。推测，StPEBP1、StPEBP3和StPEBP5也可能在马铃薯块茎形成的调控中发挥作用。通过qRT-PCR检测了StPEBP1和StPEBP3在不同组织中的表达模式，发现StPEBP1和StPEBP3同样在块茎中高表达，这进一步证实了之前的推测，即StPEBP1和StPEBP3可能在马铃薯块茎诱导途径中具有重要意义，但其功能有待进一步研究。

本试验利用生物信息学和qRT-PCR技术分析了马铃薯StPEBP家族基因在块茎诱导中的功能。除StSP5G和StSP6A外，通过表达模式分析和共线性分析猜测StPEBP1、StPEBP3和StSP3D在马铃薯块茎形成中发挥重要功能，这些基因可作为候选基因用于进一步研究PEBP家族基因在块茎诱导中的功能。

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